合成生物元件、装置和生物模块学习资料

合成生物元件、装置和生物模块Part,deviceandbioBrickinsyntheticbiology结构与合成生物学李琬生物物理教研室分子生物学馆212liwan@教学大纲掌握：元件，装置，生物模块连接方法，iGEM，基于基序合成蛋白质元件，基于分子相互作用合成蛋白质装置了解：合成生物学定义，系统，生物模块特征，生物模块特征工程氨酰基合成酶，UAA蛋白质定向进化，基于结构域合成蛋白质装置基本概念合成蛋白质元件和装置合成RNA元件和装置合成DNA元件和装置△※※△※△※基本概念合成生物学元件、装置、系统生物模块△※※合成生物学（syntheticbiology）按照一定的规律和已有的知识，设计和建造新的生物元件、装置和系统；重新设计已有的天然生物系统为人类的特殊目的服务。基于WebofScience的合成生物学文献计量分析SCI-EXPANDED5012篇入库时间为1992~2012年文章类型为论文(Article)检索策略为TI=“syntheticbiology”OR“genecircuit”OR“genecircuits”OR“geneticcircuit”OR“geneticcircuits”OR“geneticdevice”OR“geneticdevices”OR“synthetic1ife”OR“syntheticlives”OR“synthetictissue”OR“synthetictissues”OR“syntheticcell”OR“syntheticcells”OR“syntheticgenome”OR“syntheticgenomes”OR“syntheticgene”OR“syntheticgenes”OR“minimalgenome”OR“minimalgenomes”OR“essentialgene”OR“essentialgenes”OR“biology,synthetic”．合成生物学起源于工程应用目的在于简化复杂的自然生物系统，将其变为简单、可靠、质量可控的模块或者零件。使用计算机辅助设计来进行精确的预测和设计进行不同的组合以获得预期的功能在工业规模进行生产制造元件、装置、系统（1）元件（2）装置（3）系统※DNA遗传密码——指挥控制生命的软件细胞膜及细胞内所有的生物机器——生命的硬件借助电子工程的研究方法、基本技术与工具，对生命系统软件和硬件进行深入了解。系统元件2元件3元件1装置1装置2装置m元件n……（1）元件（part）具有某种特定功能的核酸或蛋白质成分，行使基本功能。启动子编码区终止子核糖体结合位点结构域（2）装置（device）一个或多个元件的组合，它们以确定的逻辑和物理连接，协调运作，包含一系列生化反应，行使规定的功能。蛋白质生成装置：产生具有一定功能蛋白质的装置。报告基因：编码荧光蛋白的基因。（3）系统（system）实现最终应用的各装置按不同形式连接的组合。遗传线路调控网络信号网络生物模块（bioBrick）经标准化加工，具有标准的限制酶切割位点的元件、装置和系统等。EcoRIXbaISpeIPstIEXSP△※（1）连接方法（2）iGEM（3）特征（1）连接方法S/X（2）iGEM

RegistryiGEM(InternationalGeneticallyEngineeredMachine)/Main_Page元件库/Main_Page包括生物模块的示意图、碱基顺序、功能等信息。图标启动子核糖体结合位点编码区终止子蛋白质生成装置？设计和构建的生物模块需要植入合适的载体细胞进行表达。大肠杆菌（3）生物模块特征行为可预测有相对独立的子功能同现有系统产生最小的相互作用便于移动，或再生产和可交换。合成蛋白质元件和装置※△合成蛋白质元件合成蛋白质装置生产非天然氨基酸（UnnaturalAminoAcid，UAA）赋予蛋白质元件以新功能和新性质，如高稳定性和蛋白酶抗性等。天然蛋白质改造合成蛋白质元件※自然界UAA硒代半胱氨酸存在于少数一些酶中吡咯赖氨酸存在于甲胺甲基转移酶中硒代半胱氨酸插入序列吡咯赖氨酸插入序列（1）工程氨酰基合成酶（2）UAA蛋白质定向进化（3）基于基序合成蛋白质元件（1）工程氨酰基合成酶（aminoacyl-tRNAsynthetase，aaRS）专一性地辨认氨基酸的侧链和tRNA，催化特定氨基酸或其前体与对应tRNA发生酯化反应而形成氨酰tRNA的酶。是接受或拒绝与tRNA偶联的特殊氨基酸的“关卡”，可以使UAA掺入蛋白质中。（2）UAA蛋白质定向进化（directedevolution）定向进化在实验室条件下创造突变，并对突变文库施加筛选压力，从而筛选出具有期望表型的突变体。随机突变+正向重组+选择不需要事先了解蛋白质的空间结构，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造基因，定向选择出所需功能和性质的蛋白质。提高UAA掺入蛋白质的速度和能力通过易错PCR或DNA改组产生各种蛋白质突变库，根据功能进行筛选。（3）基于基序（motif）合成蛋白质元件基序是与运动或活性有关的单元。序列基序：序列中重复出现的氨基酸残基；结构基序：三级结构中功能独立的短序列模块；网络基序：网络中内在联系的简单模式。基于基序与它的功能之间的联系，可以合理地编程具有所需功能的人工蛋白质。把具有不同功能的基序连接起来。在微基因单元之间的接合处插入或缺失突变串联BH基序是Bcl-2族蛋白质公用基序，涉及线粒体依赖的程序性细胞死亡。PTD是一个定位在HIV

tat蛋白质中的11个氨基酸残基的肽基序。能穿越细胞质膜，与外源分子融合或结合，可以把蛋白质、核酸或其他分子引入细胞。BH3PTD双功能蛋白质参数结构域类型结构域-配体相互作用长度结构域结构鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的方法合成蛋白质装置△（1）基于分子相互作用合成蛋白质装置（2）基于结构域合成蛋白质装置（1）基于分子相互作用（moleculeinteraction）合成蛋白质装置蛋白质-DNA相互作用双稳态开关（Bistableswitch）开关是指某种化学诱导物存在或缺乏时，或者在两个独立的外源刺激作用下，蛋白质处于两种可能状态中的一种的系统。通过人为调控实现在两种不同稳定状态间的切换蛋白质-蛋白质相互作用肌支蛋白调节蛋白进行肌动蛋白聚合磷酸化构建模块蛋白质开关自动抑制开关自动抑制结构域建立分子内相互作用，其阻断同一分子内另一结构域的活性在立体上封闭激酶结构域的活性部位，或者由于构象张力失活它的催化活性。（2）基于结构域（domain）合成蛋白质装置基于结构域相互作用合成蛋白质装置一个典型的装置由两个不连接的元件构成，元件彼此之间或者产生或者对物理相互作用应答。与另一装置的功能连接是通过蛋白质整合配对来实现的。相互作用输入装置（传感器）：转化某种信号为一种相互作用变化。雷帕霉素相互作用输出装置（调节器）：把一种连接输入装置的相互作的变化转化为一种有效的生物作用。相互作用传递装置：输入和输出相互作用变化。支架蛋白（scaffoldingprotein）或接合体重构途径支架蛋白信号转导系统中一种没有酶活性的蛋白质。含有多个结构域，能同时与多个蛋白质结合，通过辅助蛋白激酶和磷酸酶与他们各自的底物结合而起作用，将构成信号通路的蛋白质分子组装成接合体。支架接合体作用回路的集散中心，调节蛋白质的活性并执行蛋白质重新组装。因此，在信号网络中起关键作用，保证了信号传递的专一性和高效性。酵母有丝分裂原活化蛋白激酶MAPK信号重构支架作用的顺式模型支架作用的反式或簇模型教学大纲掌握：传感器和调节器元件直接偶联的RNA装置，不同信息传递功能整合的RNA装置，功能组成骨架结构——模块组装装置了解：RNA传感器，RNA调节器，RNA传递器，天然核开关，合成RNA装置的各种技术，应用合成RNA元件合成RNA装置合成RNA元件及装置△※由RNA分子组成的遗传成分行使基本生物功能基因调节指导构象改变配体结合合成RNA元件（1）RNA传感器（2）RNA调节器（3）RNA传递器（1）RNA传感器（sensor）检验信号的元件温度配体与其他RNA元件偶联温度（temperature）传感器对温度改变敏感通过选择/筛选和合理设计途径产生。同各种RNA调节器元件组合，可以把温度同基因调节联系起来。适体（aptamer）传感器核酸适体一种能够与蛋白质、小分子、离子、核酸、甚至整个细胞等目标分子结合的寡聚核苷酸。高亲和性专一性通过同靶分子定向结合相互作用传感分子信号。应用体外选择策略或配体系统进化技术从头产生。（2）RNA调节器（Actuator）控制生物过程的元件基因表达调节后转录调节定向定位控制其他生物分子的活性，影响生命和系统的反应。转录终止调节器（transcriptionterminator）终止密码子天然的，位于编码区下游。组成/选择剪接（splicing）调节器通过结合剪接体成分或其他辅助蛋白因子指导剪接事件。5’和3’剪接位点分支点增强子沉默子翻译起始调节器核糖体结合位点（RBS）翻译起始位点内部核糖体进入位点（Internalribosomeentrysequence，IRES）一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于起始位点，从而使直接从mRNA中间起始翻译成为可能。催化调节器核酶（ribozyme）具有催化功能的RNA分子，可降解mRNA序列。催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。基于RNA干扰（RNAinterference，RNAi）的调节器RNAi一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。核酸内切酶具有特定长度和结构的siRNA（约21～23bp）在细胞内RNA解旋酶的作用下解链与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物RISCRISC与mRNA的同源区进行特异性结合，在结合部位切割mRNA，mRNA随即降解。siRNA（SmallinterferingRNA）miRNAshRNA（shorthairpinRNA）通过RNAi途径沉默基因表达。基于反义（antisense）的调节器反义RNA单股RNA通过杂交控制RNA功能同终止子杂交形成反终止子，抑制转录终止。Rnase（核糖核酸酶，Ribonuclease）活性调节器Rnase识别和加工特异的RNA元件通过水解核苷酸活性作用于RNA。通过序列和结构修饰产生基于适体的翻译调节器位于5’UTR区。与配体在结合上采取一定的构象，抑制核糖体滑动，因此以依赖配体的方式降低表达水平。同配体功能活性的重要化学成分相互作用，抑制或提高翻译后分子的活性。定位（zip-code）调节器结合负责定位的蛋白质因子的序列指导各种分子、细胞区室或特殊细胞的定位。可作为顺式作用定位元件。mRNA实现较高的局部蛋白质浓度基因调节RNA和转录物实现基因调节功能的条件或提高控制支架（scaffold）调节器将多个靶分子聚集在一起，增强它们的功能联系。（3）RNA传递器(transmitter)在不同成分之间发送或转换信号的元件。通过构象改变将信息由一个RNA元件传到另一个元件。通讯模块(communicationmodule)元件以一种以上的方式与部分互补的靶链结合的单一序列。链结合的动能打开螺旋，允许元件在不同的结合状态之间移动。链转换(stranddisplacement)元件与互补的链竞争结合的两种序列。通过竞争结合，每种结合的动能允许元件在不同状态之间移动。ArenaissanceinRNAsyntheticbiologynewmechanisms,applicationsandtoolsforthefutureSmalltranscriptionactivatingRNAs合成RNA装置由一个以上不同功能的RNA元件组成能够行使生物功能△※（1）传感器和调节器元件直接偶联的RNA装置（2）不同信息传递功能整合的RNA装置（3）功能组成骨架结构——模块组装装置（4）天然核开关（5）合成RNA装置的各种技术（6）应用（1）传感器和调节器元件直接偶联的RNA装置直接把传感器和调节器元件连接在一起。信息在两个元件之间传递shRNA茶碱适体茶碱适体茶碱是甲基嘌呤类药物。具有强心、利尿、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌和兴奋中枢神经系统等作用。主要用于治疗支气管哮喘、肺气肿、支气管炎、心脏性呼吸困难。茶碱将调节器的一部分用传感器取代。适体取代基因内含子中的一个茎（2）不同信息传递功能整合的RNA装置通过传递器元件把传感器和调节器连接起来。通过传递器元件二级结构改变传递传感器和调节器之间的信息。链节序列RBS的一部分同适体碱基配对多个调节器偶联到单个装置中。偶联RBS和核酶调节器（3）功能组成骨架结构（functionalcompositionframework）——模块组装装置通过各种元件模块组装成装置。由基本的传感、调节和信息传递元件全面编程信息加工及控制功能是支持许多信息加工、转导和控制装置的组合组装。核酶自身分裂失活，降低基因表达的效率。与靶基因3’UTR偶联延展性：更复杂装置的组装核开关RNA通过结合代谢产物发生结构变化，在转录和翻译水平调控基因的表达。（4）天然核开关(riboswitch)具有天然适体的RNA遗传控制单元，把分子传感和基因调节功能联系起来，通过自身构象变化对基因表达进行调控。细菌——mRNA的5’UTR真核生物——3’UTR或内含子区。维生素B12核开关黄素单核酸核开关赖氨酸核开关鸟嘌呤核开关腺嘌呤核开关甘氨酸核开关组成适体结构域：直接结合小分子代谢物；表达结构域：与每一个天然适体专一地匹配，在序列和结构上可有明显变化。适体结构域与表达结构域之间有一转换序列。适体结构域与代谢物结合后引起适体结构域构象变化，导致表达结构域构象改变，通过变构效应调节基因表达掺入多个传感器和调节器结构域的核开关可以行使高级调节功能。类型激活型：底物存在时基因开始表达；腺嘌呤核开关抑制型：底物存在时抑制基因表达。反开关模块化结合配体的反式作用RNA装置。由DNA结合位点、一个小分子诱导物结合位点和一个链节结构域构成。在小分子配体结合后发生构象改变，影响具有反式互补序列的RNA翻译。在天然系统中日益增加的复杂行为是通过RNA控制模块的各种组合完成的。两个串联的核开关或具有多个代谢物结合结构域的单一核开关——协调控制天然基因的表达（5）合成RNA装置的各种技术合成RNA装置需要几种技术的整合。RNA传感器——天然，体外进化RNA调节器——稍加修饰的天然元件，基于相对简单的杂交规则再设计，体外进化合成RNA元件的高通量产生、设计和表征是合成RNA装置的关键。功能组成骨架结构可能是更有效的、更可靠的RNA装置设计策略和技术。需要对RNA的结构与功能关系的深入了解。In

silico工具装置设计的关键技术可以描述序列与结构的计算骨架结构以指导和最佳化RNA装置设计。需要进一步了解RNA结构-功能关系、RNA折叠动力学，以及改进RNA二级结构和三级结构的预测。（6）应用RNase调节器整合到大肠杆菌多顺子转录物的基因间隔区，造成多个靶基因的差异表达。控制合成胡萝卜素途径基于RNase调节器组合库，通过FACS筛选出所希望的表达率。合成甲羟戊酸途径整合到大肠杆菌遗传线路中的一种RNA装置检验、跟踪和精确定位分子信号。由适体和反义元件组成的RNA装置可作为控制治疗剂，其中凝血剂的适体作为拮抗剂，反义RNA作为解