高通量测序技术及其在农业上的应用

高通量测序技术及其在农业上的应用1、1什么就是高通量测序技术高通量序技术(next-generationsequencing)就是对传统Sanger法测序得一次革命性得改变,就是一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定得高通量得测序技术,同时高通量测序使得对一个物种得转录组和基因组进行细致全貌得分析成为可能,所以又被称为深度测序(deepsequencing)。

一、高通量测序技术1、2为什么要发展高通量测序技术快速和准确地获取生物体得遗传信息对于生命科学研究一直具有十分重要得意义。对于每个生物体来说,基因组包含了整个生物体得遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上得遗传信息,进而比较全面地揭示基因组得复杂性和多样性,因而在生命科学研究中扮演了十分重要得角色。1977年Sanger等发明得双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明得化学降解法,标志着第一代测序技术得诞生。尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量得测序工作,但由于其存在成本高、速度慢等方面得不足,并不就是最理想得测序方法。经过不断得开发和测试,进入21世纪后,以Roche公司得454技术、Illumina公司得Solexa技术和ABI公司得SOLiD技术为标志得第二代测序技术诞生了。1、3高通量测序技术得特点速度快准确度高成本低覆盖度深产出巨大二

高通量测序技术得原理高通量测序技术包括Roche公司得454技术、Illumina公司得Solexa技术和ABI公司得SOLiD技术。下面对三种高通量测序技术得原理和特点分别进行具体介绍。454Pyrosequencing基于磁珠得焦磷酸测序:A磁珠制备设备B454测序仪C454测序原理大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点454测序流程与BaseCalling每次加入一种碱基然后再对荧光强度进行读取。碱基聚合反应产生焦磷酸ppi,ppi在硫化酶催化下生成ATP,ATP在荧光酶催化下激发荧光,荧光强度和焦磷酸得量成正比。454技术得主要缺点就是无法准确测量同聚物(homopolymer)得长度。例如当待测序列中出现Poly(A)得情况下,测序反应中会一次加上多个T,而加入T得数目只能从荧光信号得强度来推测,有可能造成结果不准确。也正就是因为这个原因,454技术主要得错误不就是来自核苷酸得替换,而就是来自插入或缺失。454技术最大得优势在于较长得读取长度,使得后继得序列拼接工作更加高效、准确。IlluminaSolexa简介桥式PCR边合成边测序可逆终止物HiSeq2000Solexa得特点与主要应用读长较短,100－150bp通量高,25G每天,120-150G每Run主要应用:RNA测序、表观遗传学研究ABISOLiD简介SOLiD

SequencingbyOligoLigation/DetectionOligo连接测序:通过连接酶连接,再对oligo上荧光基团进行检测SOLiD5500xlABISOLiD测序前期制备A样品片段化磁珠连接B乳化PCR3‘末端修饰C磁珠富集转到测序玻片ABISOLiD测序原理测序流程依次加入五种引物进行五次测序。加入测序引物及加入oligo连接酶连接,激发荧光检测,循环一个流程,换一种引物再循环一个流程,五个流程结果叠加分析出序列。SOLiD得特点与主要应用读长较短,50-75bp精度高,可达Q40通量高,20-30G每天,1Run可达120G主要应用:基因组重测序、SNP检测等三种平台得技术差异平台454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR桥式PCR磁珠乳化PCR测序载体磁珠玻片玻片测序方式焦磷酸、荧光可逆终止物、荧光连接酶、荧光结果序列FastQFastQCSFastQ三、高通量测序技术在农业上得应用目前,高通量测序技术已广泛应用于动植物全基因组测序、基因组重测序、转录组测序、小RNAs测序和表观基因组测序等方面。下面对高通量测序技术在农业研究中得一些具体应作以介绍。3、1全基因组重测序全基因组重测序就是对已知基因组序列得物种进行不同个体得基因组测序,并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序得个体,通过序列比对,可以找到大量得单核苷酸多态性位点(SNP)、插入缺失位点(InDel,Insertion/Deletion)、结构变异位点(SV,StructureVariation),通过生物信息学手段,分析不同个体基因组间得结构差异,同时完成注释。

3、1、1利用重测序进行进化分析及SNP筛选

Lai等(2010)对6个玉米(Zeamays)骨干自交系进行了全基因组重测序,共发现

1273124个单核苷酸多态性位点(SNPs),得到30178个1～6bp得插入缺失位点(InDels),新发现得这些SNPs和InDels提供了1个高密度得全基因组标记信息,同时也鉴定出数百个基因获得与丢失变异(Presence/AbsenceVariations,PAVs)。3、1、2利用重测序技术鉴定突变体突变基因Ashelford等(2011)对一个拟南芥突变体ebi－1得回交系进行基因组重测序,随后又通过对突变体得表达数据进行调查使得候选SNPs数目得以有效缩小,最终成功鉴定出1个在AtNFXL－2基因中引起ebi－1突变表型得SNPs位点该研究证实利用回交系材料可以降低遗传背景噪音,对其进行测序分析可有效减少候选SNPs数目。3、2全基因组denovo测序

全基因组denovo测序也称为从头测序,就是直接对某个物种进行基因组全测序,然后利用生物信息学方法对序列进行拼接和组装,得到完整得物种基因组序列、基因组测序对研究物种得基因组和功能基因信息、阐明物种