第八章抗生素类药物的分析

第八章抗生素类药物的分析

TheAnalysisofAantibioticdrugs

第一节概述抗生素的来源:＊多数抗生素生物合成(发酵)＊少数化学合成或者半合成1、抗生素类药物一般检查项目：

①鉴别试验:用化学法、物理化学法以及生物学法来确认是哪种抗生素②毒性试验:控制药品中的毒性物质③无菌试验:检查药品中有无杂菌污染④热源试验:控制药品中的致热物质

⑤水分测定:控制水分含量⑥溶液澄明度检查:检查不溶性物质⑦

溶液pH试验:测定pH⑧降压试验:检查有降压作用的杂质⑨

效价测定:有效成分测定生物学法物理化学法目前各国药典仍以生物学测定法为主。2、效价测定抗生素的效价测定方法有:

(1)

生物学测定法

以抗生素抑制细菌生长能力或杀菌能力作为衡量效价标准优点：①原理恰好与临床要求一致，更能够确定抗生素效价。②灵敏度高，需要样品量较小③

既适用较纯精制品,也适用于纯度较差的产品

④

已知或新发现抗生素都能应用

⑤同一类型的抗生素,不需要分离,

可一次测定它们的总效价。缺点①

操作步骤多，测定时间较长②

误差较大(2)

物理化学测定法根据抗生素化学结构利用其特有的化学或物理化学性质及反应进行。优点①

操作简单、省时、方法准确②

具有较高的专属性

缺点:

对于结构相似的抗生素，测定结果往往只能代表总的含量，并不一定能代表某一抗生素的生物效价，只有当用物理化学法测定结果与用生物学法测定效价相一致时，才能用于效价测定。

3、本章内容＊

-内酰胺类:青霉素类头孢菌素类＊氨基糖苷类: 链霉素庆大霉素＊四环素类:第二节

-内酰胺类抗生素的分析一、化学结构与性质

1、化学结构①

青霉素类结构＊青霉素类:

母核:由

-内酰胺环和氢化噻唑环组成的双杂环。

6-APA6-AminopenicillanicAcid

侧链:RCO-

苄青霉素（青霉素G）氨苄青霉素R＝R＝②

头孢菌素类结构母核:

-内酰胺环和二氢噻嗪环组成的双杂环。（7-ACA）7-AminocephalospoanicAcid侧链RCO-

2、性质

青霉素类和头孢菌素类结构共同特点具有

-内酰胺环。①

酸性＊有羧基，具有酸性＊pKa值在2.5~2.8之间＊与碱成盐如：青霉素G钠、青霉素G钾等②

旋光性

有手性碳原子，具有旋光性3个手性碳原子2个手性碳原子③

紫外吸收

＊青霉素类母核没有共轭系统，没有紫外吸收

＊但青霉素类药物在弱酸性下水解，可以产生具有共轭双键的青霉烯酸，在紫外光区有吸收。

＊侧链中有苯环等取代基的药物，在紫外光区也有吸收。像苄青霉素。头孢菌素类分子中有共轭体系（O＝C－N－C＝C）在260nm处有最大吸收。④

-内酰胺环的不稳定性

干燥、纯净青霉素类抗生素稳定，其水溶液很不稳定.不稳定的部分是

-内酰胺环

-内酰胺环在酸、碱、青霉素酶、某些金属离子的作用下，可使

-内酰胺环开环或发生分子重排，而失去抗菌作用。ⅰⅱ

ⅲ

ⅳ

二、鉴别试验1、羟肟酸铁反应

2、青霉素的各种盐的鉴别

3、硫酸及硫酸-甲醛反应

4、硫酸-变色酸反应

5、紫外分光光度法及红外分光光度法三、含量测定①

原理青霉素在稀碱性条件下,水解生成青霉噻唑酸衍生物,此步水解定量完成,可用于含量测定。1、酸碱滴定法①

方法(ⅰ)水解前：将样品溶液的pH调至8（加0.01mol/LNaOH液至显粉红色）(ⅱ)水解：加入定过量的标准碱溶液，水浴加热使水解(ⅲ)剩余滴定：水解后，过量的碱用酸标准液回滴定(至pH8，粉红色→无色)以“青霉素钠”为例ChP90（2）空白试验：不加样品，其余操作同上（1）主试验③

讨论

(ⅰ)溶剂新沸过且用0.01MNaOH液中和的水目的：消除水中酸性物质影响（如CO2）

(ⅱ)滴定前中和消除能消耗碱的杂质影响（如一些酯类杂质）(ⅲ)空白试验目的:

在加热水解过程中，有可能会吸收CO2，对测定有影响，所以要做空白试验校正。(ⅳ)本法供试品用量较大，多用于效价高的供试品的测定2、碘量法①原理：青霉素或头孢菌素分子不消耗碘，其在碱性条件下水解生成的降解产物—

青霉噻唑酸可与碘作用，根据消耗的碘量可以计算青霉素的含量。理论上:1mol青霉素≈8molI原子;实际上:1mol青霉素≈8~9molI原子※温度，放置时间，pH，浓度，碘过量程度，杂质多少等影响因素。②方法：

以“青霉素钠”为例，ChP二部（1）主试验：（2）空白试验：③讨论：（1）溶液的pH值在4.5左右（2）温度：24~26℃（3）放置时间：15~20′（4）空白试验：做法与一般空白不同（加样品,不加碱水解,其他操作同样品）＊目的：消除样品中预先存在的降解产物（青霉噻唑酸）及其他耗碘杂质的影响（5）灵敏度高：因为1:8，所以供试液浓度在10~100μg/ml即可测定3、汞量法①原理：青霉素分子不与汞盐反应，但其降产物青霉噻唑酸及青酶胺可与汞盐反应，根据消耗的汞盐量计算青霉素的含量。

青霉素分子中的氢化噻唑环含有一个硫原子，开环后形成巯基（—SH），可用汞量法测定

4、可见—紫外分光光度法

①原理：青霉素在弱酸性下（pH=4），不完全水解，产生青酶烯酸，在320—360nm处有强吸收。

青霉烯酸在酸性溶液中极不稳定，有两种改进方法。（1）铜盐法（JP13）：

铜离子与青酶烯酸形成稳定的螯合物，在320nm处有最大吸收。对照品法定量。用于氨苄青霉素的含量测定。（2）硫醇汞盐法（BP1993,ChP95）

青霉素在咪唑的催化下，与氯化高汞定量地反应生成青酶烯酸硫醇汞盐，在324—345nm下有最大吸收。

对照品→同样操作用于氨苄西林钠的含量测定

作用：咪唑:催化剂,使水解产率高,生成产物稳定醋酐的乙腈溶液:乙酰化氨苄青霉素侧链

—NH2,使λmax=325nm

硼酸缓冲液:调pH值

HgCl2:微量Hg2+催化剂,促进反应,重现性好。

5、HPLC以“头孢唑林钠”为例色谱条件：柱：ODS

流动相：磷酸二氢钾、枸橼酸溶液—乙腈（88：12）检测波长：254nm

内标物：乙酰苯胺第二节氨基糖甙类抗生素的分析一、化学结构及性质（一）链霉素

1、结构

链霉胍N-甲基-L-葡萄糖胺链霉糖

2、性质：（1）三个碱性中心：

2个强碱性胍基（PKa=11.5）

1个甲氨基（PKa=7.7）可与矿酸或有机酸成盐（2）链霉素在酸性或碱性条件下可变为链霉胍和链霉双糖胺（二）庆大霉素1、结构紫素胺＊三个类似结构的C1、C2、C1a组成的混合物C1：R1=R2=CH3;C2：R1=CH3,R2=H;C1a：R1=R2=H,R3=HN-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺脱氧链霉胺

2、性质：（1）五个碱性中心——PKa~8

可与矿酸或有机酸成盐（2）无UV吸收，（因为无共轭系统）二、鉴别试验（一）共同反应

1、茚三酮反应氨基糖苷结构，具羟基胺类和α-氨基酸的性质，可与茚三酮缩合成蓝紫色缩合物。

2.N-甲基葡萄糖胺反应:

水解产物N-甲基葡萄糖胺特有反应（二）链霉素的特征反应1、麦芽酚反应：链霉素在碱性溶液中，链酶糖经分子重排，消除N—甲基葡萄糖胺及链酶胍，生成麦牙酚，麦牙酚可与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。

2、坂口反应：

本品水溶液，加氢氧化钠试液，水解为链酶胍，与8—羟基喹啉作用，再加次溴酸钠试液，生成橙红色化合物。第三节四环素类抗生素的分析一、化学结构四骈苯或萘骈萘的衍生物，氢化骈四苯环四个取代基RR1R2R3四环素(TC)HOHCH3H金霉素(CTC)ClOHCH3H土霉素(OTC)HOHCH3OH四个环A环B环C环D环二甲氨基—N(CH3)2酚羟基酰胺基—CONH2酮基与烯醇基共轭酮基与烯醇基共轭双键系统双键系统二、性质

1、呈两性：弱酸性——酚羟基、烯醇型羟基弱碱性——二甲胺基所以遇酸或碱均可成盐2、含结晶水四环素：6个结晶水占19.6%土霉素：2个结晶水占7.5%

加热时可失去结晶水,当含水量低于19.6%的四环素和低于7.5%的土霉素,置于空气中要吸收水分。

3．

溶解度：游离体在水中溶解度很小，溶解度与pH有关。pH4.5~7.2难溶于水,pH低于4或高于8时,可以得到高浓度的水溶液.4．对氧化剂不稳定：对各种氧化剂都不稳定，且碱性水溶液特别易氧化，颜色很快变深形成色素，干燥品较稳定，但贮存时遇光可使颜色变深（因空气氧化）。三．化学反应：1.差向异构化反应：（差向四环素）弱酸性（pH2.0~6.0）溶液中，A环上手性C4构型的改变，发生差向异构化，形成差向四环素。差向化速度的影响因素：pH<2或pH>9时，差向化速度很小。高价的无机酸或有机酸根存在或阴离子浓度增加，差向化速度增大。＊四环素和金霉素很易差向异构化，形成4-差向四环素、4-差向金霉素，他们的抗菌性极弱或完全消失。＊土霉素和强力霉素由于C5上的羟基和二甲胺基形成氢键，不易发生差向异构化。

2.酸性下降解反应:（脱水四环素类）在酸性（pH<2）时，C环上C6上羟基易脱落与C5a上的氢生成水，在C6-C5a间形成双键。经重排使C环芳构化，生成脱水四环素类四环素、土霉素和金霉素可发生脱水；

3.碱性下降解反应：（异四环素类）

在碱性下，C环打开，生成无活性的具有内酯结构的异四环素；若强碱性下加热，可定量地转化为异四环素，后者具有强烈荧光，可荧光法测定。

4.与金属离子络合：

能与许多金属离子（锆Zr4+,铀U6+,锌Zn2+,铜Cu2+,铝Al3+,镁Mg2+，铈Ce4+,钴Co2+）形成有色络合物。四．鉴别

1.

与浓硫酸反应：四环素类+浓H2SO4

→深紫色（四环素）蓝色,迅速转变为绿（金霉素）朱红色（土霉素）2.FeCl3反应：

四环素类酚羟基+FeCl3

→红棕色（四环素）深褐色（金霉素）