DB51-T 2964-2022 口岸松材线虫疫情监测技术规范

DB51Technicalstandardformonitoringthepinewoodnem四川省市场监督管理局发布I 1 1 1 3 3 3 3 4 6 6 7 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起本文件起草单位：成都海关技术中心、宁波海关技术中1口岸松材线虫疫情监测技术规范验室检测、监测样品的保存及处理、监测结果GB/T23476-2009松材线虫病检疫技GB/T23478松材线虫普查监测SN/T1724-2006进境针叶树原木、木制品和木质包装材料中松材线虫的检SN/T4350-2015旅客携带物和邮寄物检疫鉴定学名：Bursaphelenchusxylophilus(寄生滑刃亚科（Parasitaphelenchinae伞滑刃属（Bursaphelenchus能引起松树萎蔫病，是针叶树木上最重要的病原生物之一。松材线虫相关信息参松褐天牛MonochamusalternatusHope,18432又名松墨天牛、松天牛，属于天牛科（Cerambycidae）、墨天牛属（Monochamus），是为害松树云杉花墨天牛MonochamussaltuariusGebler,1830又名云杉花黑天牛，属于天牛科（Cerambycidae）、墨天牛属（Monochamus），是一种蛀干性昆松木及其制品pinewoodandwoodenw木质包装材料woodpackingma色物将胞壁染色，促使木材蓝变的现象。蓝变是判断松材线虫监测抽样的一个重海关指定监管场地customsdesignatedsupervisio高风险动植物及其产品实施查验、检验、检海关监管货物cargounderc减免税货物，以及暂时进出口货物、保税货物和34监测范围垫材料、运输工具、邮寄物及旅客携带物。松材线虫的寄主植物范围参见附录A.牙以及中国台湾等国家或地区的松木及其制品、邮寄物及旅客携重点抽取材质干燥无松脂香味、有蓝变、有媒样品标识信息应完整、清晰，确保可溯源、可追查，规范填写附录表B4诱捕时间一般为每年的4月下旬至10月底（不同地区有差异），即松墨天牛成虫羽化初期开始，直诱捕器下端离地面1.5m～2.0m。诱捕器上下两端应用铁丝绑牢并固定，正确添加或更换引诱剂，应注照GB/T23476-2009中附录C执行。分离时室内温度应保持在20℃~30℃之间，或置于恒温培养箱中进置体视显微镜下镜检（放大倍率10X～20X为宜）。媒介昆虫样品的分离分离线虫，也可直接浸泡于加水的表面皿或培养皿中，2h后在体视显微镜下直接观察是否有线虫。以避免漏检），转移到载玻片上，液滴体积50µL左右为宜。在酒精灯上以1s左右的频率通过8次~10次，使线虫恰好被杀死为宜。加盖玻片，制成临时玻片。若分离的线虫均为幼虫或数量极少影响后球、尾部，尤其注意雌虫阴门区以及雄虫交合刺，并拍摄显微照片。一般在40倍物镜下，拍摄雌虫头5部、阴门区、尾部各1张照片，拍摄雄虫头部和尾部各1张照片，必要时在100倍油镜下拍摄。显微镜配测量并计算体长/虫体最宽处体宽（a）、体长/尾长（c）、尾长/肛门处体宽（c’）等值。如样品足够，应测量雄虫、雄虫各20条以上。测计方法参考SN/T27松材线虫特异PCR检测见附录E，实时荧光PCR检测见附录F，DNA条形码鉴定见复核提供复核的材料为具松材线虫雌雄成虫的线虫分离液9监测样品的保存及处理6），7A.1发现历史和背景松材线虫最早于1929年从美国德克萨斯州的长叶松（Pinuspalustris）木材中分离到，被描述为树枯死的记录，损失巨大，但长期未找到病因。直到1971年等确认其为异名，松材线虫从此被定名为Bursaphe1970。A.2地理分布美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、西班牙、葡萄A.3侵染循环松材线虫通过墨天牛属（Monochamus）昆虫在寄主植物间传播。天牛蛹中羽化后即将离开寄主树通过伤口进入松树后，立即转为繁殖阶段，4d～5d即可发育为成虫。松材线虫利用天牛的发育过程，通过取食和产卵这两种途径，传播到新的寄A.4传播途径8本松材线虫的传播媒介为松褐天牛（M.alternatus）、云杉花墨天牛（M.saltuarius），北美洲为卡罗来纳墨天牛（M.carolinensis），葡萄牙为樟子松墨天牛（M.galloprovincialis）。天牛科其它属及鞘翅目树加工成的木质包装材料中经常被截获。因此，松材线虫A.5松材线虫生活史段。在25℃的有利条件下，松材线虫从卵开始，经过4个繁殖阶段的幼虫龄期（J1至J4），在4虫在肠道细胞中积累脂肪，可在干旱、低温或营养缺乏的逆境下存活。通常该龄幼虫蜕皮成为分散型4龄幼虫JIV（持久型幼虫），再由媒介甲虫传播给新的树木。然而，如果条件变得适合线虫发育，例如将分散型3龄幼虫JⅢ接种到真菌培养皿中，线虫会发育成为繁殖型4龄幼虫J松材线虫的寄主主要是松属（Pinusspp.）针叶木，我国寄主主要加拿大云杉（P.canadensis）、北美云杉（P.pungens）、欧洲落叶松（Larixeuropaea）、美加落叶松松属以外的寄主很少在感染松材线虫后死亡。目前仅美国报道蓝杉（Piceapungens）和花旗松（Pseudotsugamenziesii）感染松材线A.7松材线虫雌虫尾形变化综述然而，这不是绝对的。许多学者的研究证实的占77%（其中圆尾型占44%超过1μm（1.46μm～3.41μm）的占23%。2005年，赵文霞等报道到黑松后重新分离，4.2%雌虫有尾尖突；接种到油松上，15%雌虫有尾尖突，但未测量尾尖突长度。尖突，平均长度约为1.7μm，最长达2.9μm。但该线虫经灰葡萄孢培养后，所有雌虫尾均宽圆，无尾度为0.5μm～1.2μm，较本文的群体更短。2011年，顾建锋等报道了一种美国木质包装中截获的松材线虫，从木质包装中直接分离获得的雌虫约一半尾端宽圆，无尾尖突；其余则有很短的尾尖突，约0.5μm～1μm。但经过灰葡萄孢人工培养一月后，超过一半雌虫有1μm～2μm的尾尖突，另有大约10%的雌虫尾尖突为2μm～2.4μm，其余雌虫则无尾尖突或小于0.5μm。2020年，顾建锋等从辽宁红松分离9到一种具明显尾尖突的松材线虫，其雌虫尾末部分均有或长或短的尾尖突，末端钝圆或锐尖，长1.8松材线虫雌虫均有尾尖突、或者尾尖突长度超过2μm的情况是比较罕见的，从实验室对上千批次松材末端宽圆，无尾尖突。群体内一些雌虫有短尾尖突，但长度不超过2μm。并且，通常群体内总能发现号【检查时间】具体到年月日；——伪伞滑刃线虫B.fraudulentusRühm，1956（J.B.Goodey，1960）——拟松材线虫B.mucronatu——灰黄锦天牛伞滑刃线虫B.luxurio——杨伞滑刃线虫B.populiTomalak&Filipiak，2010——拟灰黄锦天牛伞滑刃线虫B.paraluxuriosaeGu,Wang,Braasch,2012——日本冷杉伞滑刃线虫B.firmaeKanzaki,Maehara,Aikawa&Matsumato,2012——韩国伞滑刃线虫B.koreanusGu,Wang&Chen,2013——吉拉尼伞滑刃线虫B.gillaniiSchönfeld,Braasch,Riedel&Gu,2013——锦天牛属伞滑刃线虫B.acaloleptaeKanzaki,Ekino,Maehara,Aikawa&Giblin-Davis,20松材线虫组线虫均具有以下共同鉴定特征：侧线4条；典型的雄虫交合刺形状（较长、弓形，喙突明显，远端一般有盘状突：均与松材线虫交合刺形态相似）；尾乳突7个，P4明显，P3和P4邻近且位于交合伞起始处；雌虫阴门盖较长（图C.1）。上述特征中，由于侧线和尾乳突特征有时在光学显微镜下）；注：A.持久型幼虫；B.繁殖型幼虫；C.雌虫；D.雄虫；E.繁殖型幼虫体前端；F.雌虫阴门区；G.繁殖型幼虫尾部；注：该群体为红松中分离到的松材线虫，其雌虫3%，其余绝大部分均有或长或短的尾尖突，末端钝圆或锐尖，长1.8μm±0.7μm(0.3μm～3.2葡萄孢人工培养后，所有的雌虫尾端钝圆，均无尾尖突。A～N.直接从红松样品分离到的松材线虫雌虫尾形；图D.4辽宁红松中分离到的松材线虫注：A.体前部；B.中食道球区；C、E.雄虫尾部；D.雌虫阴门区；F～I.雌虫尾部。松材线虫M型株系雌虫具有长约2.2μm～3.0μm的尾尖突，且经人工培养后仍如此。而松材线虫R型株系尽管有些个体会有短尾尖突，甚至有些群体大部分都有尾尖突，但尾尖突一般在人工培养后消失。目前M型松材线虫仅分布于北美，其寄主主要是注：A.头部；B.交合伞及尾乳突；C-D、F-GABDCABDCEFHGEFHGJILKJILK注：A-B.阴门；C.交合刺；D.交合伞；E-H.培养后雌虫尾部；I-L.原木中分注：A、B.头部；C.雌虫阴门盖；D.雌虫阴门至尾末端；E-F.培养后的雌虫尾部形态；G.木质包装中直接分离的雌μLPCR管中（含8μLddH2O和1μL10×PCR）），），加热10min，即得到线虫DNA模板。得到的DNA提取液可直X-FX-R222ddH2O以松材线虫DNA模板作为阳性对照，以不含松材线虫的DNA模板作为阴性对照，以ddH2O作为空V/cm～5V/cm电场强度电泳，约0.5h，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统上拍照并保留结果。采用X-F/X-R引物对扩增后，电泳检测得到与阳性对照一致的560bp左右大小的特有条带J10-1/J10-2Rc引物对得到160bp左右大小的特有条带，判定结果为阳性；否则判定结果为阴性。每个样品设置3个平行实验，同时每次检测设立3个对照，分别为：含有松材线虫DNA的阳性对照，2212ddH2O荧光信号的收集条件应与探针的荧光基团一致，具体设置方法参照相应荧光P应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct 该引物正常的PCR扩增产物片段大小为800bp左右，若样品PCR扩增获得正），使用Chormas软件或其他序列分析软件，对28S基因测序得到的双向峰图文件（后缀名.ab）进行拼接。为确保DNA条形码序列的可靠性，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端峰形杂乱的低质量序列，并去除引物所在序列区域，获得相应的DNA序列。拼接完成后，DNA序列方向应与PCR扩增正（/Blast.cgi）进行比对。在BasicBLAST中选择nucleotideblast，在Enter（Per.Ident）。在BLAST结果中查看序列相似性最高若待测样品序列与已知的松材线虫序列（AY508107.1、EF446929.1-EF446933.1、EF446935.1、AM396580.1等）相似性（Per.Ident值）达98.98%以上，与其他种类的相似性材线虫阳性。若待测样品序列与已知的松材线虫相似性低于98.98%如BLAST结果所显示的线虫不是伞滑刃属线虫，甚至不是线虫，很可能是实验过程中由于操作不[1]顾建锋,王江岭.伞滑刃属线虫形态和分子鉴定图谱[M].厦门大学出版社,2011.[2]刘伟,杨宝君.松材线虫和拟松材线虫雄虫交合伞形状的比较[J].林业科学研究,1995,10(2):223-225.[3]夏永刚,王明旭,张玉荣,等.临湘市具尾尖突松材线虫病病原的鉴定及病源分析[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2009.[4]赵文霞,杨宝君.松材线虫雌虫尾部形态和寄主的关系[J].林业科学研究,2005,18(3):362-363.[5]郑炜,顾建锋,吴昊,等.宁波马尾松中松材线虫形态变异研究[J].浙江林业科技,2007(03):38-40.[6]BraaschH,BurgermeisterW,GuJ.Revisedintragener(Nematoda:Aphelenchoididae).JournalofNematodeMorphologyandSystematics,2009,12:65-88.[7]KiyoharaT,TogushigeY.Inoculationexperimentsofanematode,Bursaphelenchussp.trees[J].NihonRingakkaiShi/JournaloftheJapaneseForestrySociety,1971,53(7):105-114.[8]Mamiya,Yasuharu,Enda,Nobuo.TransmissionofBursaphelenchusLignicolus(Nematoda:Aphelenchoididae)ByMonochamusAlternatus(Coleoptera:Cer