生物中图版学案：第六章第一节蛋白质的提取和分离

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精第一节蛋白质的提取和分离1．了解提取生物大分子的基本思路和方法.2．尝试蛋白质的提取。一、蛋白质分离提纯技术将生物体内的蛋白质提取出来并加以分离,就可以得到高纯度的甚至是单一种类的蛋白质。1．蛋白质分离提纯技术包括离心技术、层析技术和电泳技术等.其中,电泳技术最为快捷灵敏、简便易行.2．电泳原理蛋白质含有游离的氨基和羧基,是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷。作为带电粒子，蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动，这就是电泳现象.蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快;电荷数相同时，相对分子质量越小,则移动越快。3．不同蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹。每一种带纹可能就是一种蛋白质。将这些带纹一个一个地剪下来，分别予以洗脱，然后对洗脱液中的蛋白质做进一步的分离。如果待测洗脱液不能再分离，则这个带纹中很可能含有一种单纯蛋白质。如果待测洗脱液还能再分离,则这个带纹中含有多种蛋白质，需要作进一步分离，直至提纯。二、血清蛋白的提取和分离1．新鲜血液在体外凝固后，会析出清亮的淡黄色液体-—血清。血清中含有丙种球蛋白、凝集素等多种蛋白质.2．过程（1）点样：取新制血清与蔗糖溶液及溴酚蓝指示剂等体积混匀后，小心加到电泳样品槽的胶面上.(2）电泳。（3）染色：取出凝胶,放入考马斯亮蓝R250染色液中.染色与固定同时进行,使染色液没过胶板，染色30min。（4）脱色：用醋酸溶液浸泡漂洗数次，每隔1~2h更换脱色液,直至底色脱净，背景清晰。（5）制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡3~4h,然后放在两层透气玻璃纸中间,自然干燥即可获得血清蛋白的电泳谱带。三、其他蛋白质的提取与分离1．牛奶中酪蛋白的提取与检测当pH＝4.8时，酪蛋白的溶解度降低，并析出沉淀。用酒精除去酪蛋白沉淀中的脂肪后，即得到纯的酪蛋白。酪蛋白中含有酪氨酸，能与米伦试剂起颜色反应，首先生成白色沉淀，加热后变成红色.2．卵清蛋白质的分离选取鸡、鸭、鹅、鹌鹑等动物的新鲜卵清作实验材料。采用电泳法分离卵清蛋白质.思考：可否利用蛋白质的提取与分离技术快速诊断早期癌变?提示：可以。只需从早期患者的尿液、血液或细胞裂解液中提取少量蛋白质样品,采用蛋白质指纹图谱技术，就可以更加快速、简便、准确地对细胞癌变作出诊断。1．电泳许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下,这些基团会带上正电或负电.在电场的作用下，这些带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电粒子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离.两种常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，在测定蛋白质相对分子质量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。而在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，SDS能使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的相对分子质量；同时SDS所带的大量负电荷能掩盖不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。2．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量时，可选用一组已知相对分子质量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知相对分子质量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和相对分子质量的对数作标准曲线,可以测定未知蛋白质的相对分子质量。具体步骤如下：（1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板；（2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备;（3）样品处理；（4）把凝胶固定于电泳装置上；（5）加样:按顺序加样,加样量通常为10～25μL，样品可以多加几个；（6)电泳；(7）剥胶;（8）染色；（9）脱色;（10）观察结果。SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED和过硫酸铵对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定要按照实验要求和步骤，在老师的指导下完成.操作时要戴好一次性手套。题型一电泳技术的原理【例题1】关于电泳的说法不正确的是（)。A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B．带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极移动C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少D．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小解析：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。答案:C反思领悟：反思领悟:电泳利用了分离样品中各种分子带电性质不同以及分子本身的大小、形状不同,使带电粒子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。题型二蛋白质的提纯【例题2】（2011·广东理综）以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是（）.A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D．在凝胶色谱法分离过程中,血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢解析：大分子物质由于分子直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快,相反,分子质量较小的物质向下移动速度较慢。答案：D1电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快？（）A．纤维状、大分子B．纤维状、小分子C．球状、大分子D．球状、小分子解析：电泳就是利用了连续分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同。一般来说，球状分子比纤维状分子易移动，小分子比大分子易移动。答案:D2下面说法不正确的是（）.A．分离胶和浓缩胶单独存在时具有神经毒性，应避免接触皮肤B．电泳需要支持物，常用的是聚丙烯酰胺凝胶C．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程D．透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内解析：透析袋一般是用硝酸纤维素（又叫玻璃纸）制成的.透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内.透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液.答案：D3在盛有红褐色的Fe（OH）3胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐加深,这