分子生物学第三章蛋白质大分子结构与功能

第三章蛋白质大分子1本章内容第一节蛋白质大分子构造与功能第二节蛋白质生物合成2第一节蛋白质大分子构造与功能3一、蛋白质的生物学意义〔功能〕蛋白质的生物学意义〔功能〕构造功能例如：膜蛋白、糖蛋白、核蛋白催化功能例如：酶运输功能例如：载体，某些跨膜蛋白运动功能例如：肌球蛋白和肌动蛋白防御功能例如：抗体调控功能例如：阻遏蛋白,再激活因子恩格斯认为：蛋白质是生命的表现形式4膜蛋白5HA链球菌透明质酸的代谢网络透明质酸生物合成过程6糖蛋白生物膜是磷脂双分子层嵌有蛋白质的二维流体7

物质的跨膜运输

转运蛋白介导的主动运输〔载体蛋白〕与被动运输〔载体蛋白和通道蛋白〕8TheProtonPump9问题先有蛋白质，还是先有核酸？先有DNA,还是先有RNA?10二、蛋白质的元素组成四大生命元素：C、H、O、N有的蛋白质还有：磷、铁、锌、铜、钼等氮在各种蛋白质中平均含量为16%。例题:通过凯氏定氮法测得某细菌培养物的N含量为1.25g,问该细菌中蛋白质含量为多少?

11三、蛋白质的氨基酸组成组成蛋白质的根本单位是氨基酸。如将天然蛋白质完全水解，最后都可得到约二十种不同的氨基酸。除脯氨酸外，其余均属于α-氨基酸1213(一)氨基酸构造通式羧基写在α-碳原子上端，氨基在左边为L-型，氨基在右边为D-型14(二)氨基酸的分类根据组成蛋白质的20种氨基酸的侧链R基的化学构造，分为：脂肪族氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸芳香族氨基酸：苯丙氨酸杂环氨基酸：组氨酸、色氨酸杂环亚氨基酸：脯氨酸

15根据R侧链基团解离性质的不同，可将氨基酸进展分类：

1.极性氨基酸：(1)酸性氨基酸——Glu，Asp；侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷的氨基酸。

(2)碱性氨基酸——His，Arg，Lys；侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷的氨基酸。

(3)中性氨基酸——侧链基团在中性溶液中不发生解离，因而不带电荷的氨基酸：Ser,Thr,Asn,Gln,Tyr,Cys

2.非极性氨基酸：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe。16〔三〕氨基酸的理化性质1．两性解离及等电点氨基酸分子是一种两性电解质。通过改变溶液的pH可使氨基酸分子的解离状态发生改变。

氨基酸分子带有相等正、负电荷时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点〔pI〕。

17182．紫外吸收性质组成天然蛋白质分子的20种氨基酸中，只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸收。其吸收峰280nm左右，以色氨酸吸收最强。可利用此性质采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量。193.氨基酸的化学性质与茚三酮反响生成兰紫色物质，但脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质。与DNFB反响生成稳定的黄色2，4-二硝基苯氨酸〔DNP-氨基酸〕。DNP-氨基酸在有机溶剂中与其它氨基酸溶解度不同，用乙醚抽提，根据纸层析上的黄色斑点可鉴定N-端氨基酸的种类和数目〔Sanger等用此法测定了胰岛素的一级构造〕20氨基酸与异硫氰酸苯酯的反响AA的氨基可与异硫氰酸苯酯(PITC)反响,生成苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-AA)。所得PTC-AA经乙酸乙酯抽提→层析鉴定→确定N端氨基酸的种类。“多肽顺序自动分析仪〞据此原理。生物公司已经进展蛋白质测序21英国生化学家弗雷德·桑格尔〔FrederickSanger，1918年8月13日—〕,分别获得1958年和1980年诺贝尔化学奖。他是同一领域内两次获奖，两次获奖理由都可归结为：测序。1958：弗雷德·桑格尔创造酶法测定人胰岛素序列，从而确定胰岛素的分子构造，开创了蛋白质测序领域。1980：弗雷德·桑格尔、沃尔特·吉尔伯特共同荣获诺贝尔化学奖。他们奉献在于：分别使用不同的方法测定DNA序列。Sanger法后来成为主流，并用于人类基因组方案〔HGP〕的测序。22蛋白质构造23四、肽肽：一个AA的α-羧基和另一个AA的α-氨基脱水缩合而成的化合物。肽建：氨基酸之间脱水后形成的键，又称酰胺键24肽链中的氨基酸因脱水形成肽键而称为氨基酸残基肽的命名：例如谷胱甘肽肽与蛋白质的界定信号肽2526肽平面27肽的实例谷胱甘肽作为辅酶，在体内氧化复原过程中起作用催产素和加压素促肾上腺皮质激素脑肽2829四、蛋白质的构造蛋白质构造分为：一级构造、二级构造、超二级构造、构造域、三级构造、四级构造〔一〕蛋白质的一级构造：蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序。一级构造在很大程度上决定其高级构造。30二硫键31一级构造确定的原那么测定蛋白质中氨基酸组成蛋白质N端和C端的测定2种以上方法水解蛋白质，得到一系列肽段别离提纯所得肽，测其序列从有重叠构造的肽序列中推断蛋白质的全部氨基酸的排列顺序32〔二〕蛋白质的空间构造肽平面：肽腱中的4个原子以及相邻的2个α-碳原子处在同一平面，使肽链具有一定的稳定性331.蛋白质二级构造：α-螺旋、β-折叠、β-转角、自由回转等α-螺旋构造特点:每隔3.6个氨基酸残基上升1圈。向上平移0.54nm,即每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm。α-螺旋体中氨基酸残基侧链伸向外侧，相邻螺旋之间形成氢键，氢键方向与中心轴平行。分左手螺旋和右手螺旋。343536α-螺旋β-折叠

肽链按层排列，依靠相邻肽链＞C＝O和＞N－H形成的氢键维持构造稳定。平行排列：所有肽链的N端处于同一侧，是同方向的。反向平行：肽链的N端一顺一倒排列。反向平行构造更稳定。37红球代表O原子;白球代表N原子紫色球代表R侧链；38红球代表O原子;白球代表N原子；紫色球代表R侧链3940β-转角多肽链中180度回折，第一个AA残基的＞C＝O和第四个AA残基的＞N－H形成的氢键41自由回转无规那么卷曲,没有一定规律的松散构造,酶的功能部位常常处于这种构象区域里。422.超二级构造和构造域超二级构造：假设干相邻的二级构造中的构象单元,形成二级构造组合体。例如，βαβ，βββ，αα，ββ等。43444546构造域多肽链在超二级构造根底上进一步卷曲折叠成严密的近似球状的构造。对较小蛋白质分子，构造域往往就是三级构造，即这些蛋白质是单构造域。许多蛋白质是多构造域。47构造域483.蛋白质三级构造多肽链的某些区域氨基酸形成二级构造:α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规那么卷曲等构象单元,然后相邻二级构造集装成超二级构造,进而折叠绕曲成构造域,由2个或2个以上的构造域组装成三级构造。如肌红蛋白。494.蛋白质四级构造一个蛋白质由几条多肽链组成1个活性单位。亚基的相互关系，空间排布，亚基间通过非共价键聚合成的特定构象。单一亚基无活性，只有聚合后才有生物活性。如血红蛋白。5051蛋白质预测网站

ComputepI/WM://expasy.hcuge.chPredictprotein://embl-heidelberg.de/predictprotein/SOPMA://ibcp.fr/predict.htmlUnpredict://www/52蛋白质信息资源〔PIR):///Dan/proteins/pir.html蛋白质构造数据库〔PDB):///北大生物信息学中心://53MKRSKRFAVLAQRPVNQDGLIGEWPEEGLIAMDSPFDPVSSVKVDNGLIVELDGKRRDQF

DMIDRFIADYAINVERTEQAMRLEAVEIARMLVDIHVSREEIIAITTAITPAKAVEVMAQ

MNVVEMMMALQKMRARRTPSNQCHVTNLKDNPVQIAADAAEAGIRGFSEQETTVGIARYA

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IAIPDERILAIYNALRPFRSSQAELLAIADELEHTWHATVNAAFVRESAEVYQQRHKLRK

GS

等电点/分子量理论值:5.26/92840.80

举例--甘油脱水酶的3个亚基序列54DeducedsecondarystructureoffusionproteindhaB123Alphahelix(Hh):399is47.39%310helix(Gg):0is0.00%Pihelix(Ii):0is0.00%Betabridge(Bb):0is0.00%Extendedstrand(Ee):125is14.85%Betaturn(Tt):76is9.03%Bendregion(Ss):0is0.00%Randomcoil(Cc):242is28.74%Ambigousstates(?):0is0.00%Otherstates:0is0.00

55Green:αsubunitYellow:theactivesiteCyan:βsubunitGray:γsubunitMagenta:B12molecule

甘油脱水酶空间构造56〔三〕蛋白质分子中的共价键与次级键共价键：肽键、二硫键次级键：氢键、盐键、疏水键、范德华力。57五、蛋白质分子构造与功能的关系〔一〕蛋白质一级构造与功能的关系种属差异分子病〔二〕蛋白质构象与功能的关系别构现象〔变构效应〕：蛋白质表现其功能时构象发生变化。5859六、蛋白质的性质〔一〕蛋白质的相对分子量〔二〕蛋白质的两性解离及等电点蛋白质等电点：溶液在某一pH值时，蛋白质所带正电荷与负电荷相等，在电场中，蛋白质分子既不向正极也不向负极移动。此时溶液的pH值称为蛋白质等电点。60蛋白质电泳蛋白质电泳的方向取决于所带电荷的正负性、所带电荷的多少、及分子颗粒大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳61掩盖了其他因素，电泳时只与分子量有关6263SDSSDS642DE仪器系统恒温水浴垂直板电泳仪〔第二向〕电源等电聚焦仪〔第一向〕65Comparisonoffluorescentlabelled2-DgelwithsilverstainingCyTM5labelledgelSilverstainedgelE.colilysate,50

gloading,pH4-766〔三〕蛋白质的胶体性质透析法：小分子可以通过半透膜，而蛋白质不能，从而到达别离纯化的目的。蛋白质分子外表分布着许多极性和非极性基团，非极性基团与脂溶性物质结合。而极性基团与水溶性物质结合形成水化层，水化层使蛋白质颗粒相互排斥，不会凝结沉淀。67〔四〕蛋白质的沉淀反响加高浓度盐类：破坏水膜加有机溶剂：破坏水膜加重金属盐：蛋白质与重金属离子生成不易溶解的盐而沉淀。68〔五〕蛋白质的变性因受物理或化学因素的影响，蛋白质的分子构造发生变化，致使蛋白质的理化性质和生物学性质都有所改变，但一级构造不变。69〔六〕蛋白质的颜色反响双缩脲反响：米伦氏反响：乙醛酸反响：坂口反响：酚试剂反响：70七、蛋白质的分类简单蛋白质：只由α-氨基酸组成结合蛋白质：简单蛋白质+非蛋白质局部〔辅基〕核蛋白：核酸+蛋白质糖蛋白与蛋白聚糖脂蛋白：脂类+蛋白质色蛋白：色素+蛋白质磷蛋白：磷酸+蛋白质71名人传记王应睐72王应睐研究员,曾任中国科学院上海

分院院长，中科院上海生化所所长，比利时、匈牙利、捷克等国科学院名誉院士，1955年被选为中国科学院学部委员(院士)。王应睐院士是我国著名的生物化学家、近代生物化学科研事业的主要奠基人。首次证明豆科植物中含血红蛋白。成功地组织了人工合成结晶牛胰岛素与酵母丙氨酸转移核糖核酸两项重大根底性研究工作。1996年获香港何梁何利基金科学技术成就奖。73名人传记邹承鲁邹承鲁,1923年生,江苏无锡人。1951年获剑桥大学博士。中国科学院院士，第三世界科学院院士,生物物理所研究员。曾任中科院生物学部主任,全国政协委员、常委,中国生物化学与分子生物学会理事长。在国内外发表科学论文二百余篇。由于在胰岛素人工合成，蛋白质和酶学方面的奉献，曾获第三世界科学院奖、陈嘉庚生命科学奖、国家自然科学及中科院自然科学奖屡次。自传在国外出版的综合生物化学丛书·生物化学史卷发表,对当代生物化学开展的奉献已载入史册。74邹承鲁照片75邹承鲁简历：由王应睐教授介绍去剑桥大学师从Keilin教授第一篇论文1949年在英国Nature杂志上发表，导师Keilin教授不署名1951年回国，在中国科学院上海生物化学研究所建立了研究组参与结晶牛胰岛素的人工全合成1970年由上海调到北京生物物理所工作76科学家的境界追求

心无旁骛，割席断交

管宁、华歆共园中锄菜，见地有片金，管挥锄与瓦石不异，华捉而掷之去。

又尝同席读书，有乘轩冕过门者，宁读如故，歆废书出看。宁割席分坐曰：子非吾友也。

77小结重要概念：等电点肽健肽平面α-螺旋β-折叠β-转角超二级构造构造域别构现象结合蛋白盐析蛋白质的构造：一级构造→二级构造→超二级构造→构造域→三级构造→四级构造有关蛋白质的化学反响蛋白质的别离提纯78第二节蛋白质生物合成79遗传密码80蛋白质合成概述DNA:ATGCATGCATGCRNA:AUGCAUGCAUGCProtein:aa1aa2aa3aa4碱基序列决定氨基酸序列如何实现碱基序列到氨基酸序列的转变？81TACTTTAAAGTATranscription-TheProductionofmRNARNAPolymerasebeginstowork!!StartHere!!AUUGGAAAAAAAStopHere!!82TACTTTAAAGTA83mRNAmovesoutofthenucleustoRoughEndoplasmicReticulumRoughERNuclearMembraneRibosomesmRNA84AAAGUATranslation-ProteinSynthesisCodonCodonUUUtRNAAntiCodonUACtRNAMethionineUUUtRNAPhenylalanine85Polypeptideformationviapeptidebonds.Translation-ProteinSynthesisRibosome(s)movealongmRNA.tRNAcarriersaminoacidsforbuildingpolypeptide.tRNAdropsawayfromribosome/mRNAonceamino-aciditcarriesisjoinedontothegrowingpolypeptideviapeptidebonds.86Primary,Secondary,TertiaryandQuaternaryStructure-ProteinSynthesisPrimarySecondaryTertiaryUnfoldedsinglepolypeptidestrandFoldedsinglepolypeptidestrand-Secondary&TertiarySeveralpolypeptidestrandsQuaternary87Translation-bigpictureInitiation:RecruitfMet-tRNAMet,mRNA,largeparticleElongation:SynthesizeproteinTermination:Stopsynthesis,releaseprotein88一、mRNAmRNA概念最初由F.Jacob和J.Monod1965年提出．当时推测，有一种信使在细胞核中合成后携带上遗传信息进入细胞质，指导蛋白质合成，后来发现，除rRNA和tRNA之外的第三种RNA，称为信使RNA(mRNA)。mRNA半衰期很短,一旦完成使命就被水解。原核生物和真核生物mRNA的构造差异较大，尤其是在5’端。89〔一〕原核生物mRNA的构造

1、

5’端SD序列在起始密码子AUG上游9-13个核苷酸处，有一段可与核糖体16SrRNA配对结合的、富含嘌呤的3-9个核苷酸序列，一般为AGGA，此序列称SD序列。它与核糖体小亚基内16SrRNA的3’端一段富含嘧啶的序列GAUCACCUCCUUA-OH〔暂称反SD序列〕互补，形成氢键。使得结合于30S亚基上的起始tRNA能正确地定位于mRNA的起始密码子AUG。90Ribosomebindingsite(RBS)orSD-sequenceinprokaryoticmRNA,complementarywiththesequenceatthe3’endof16SrRNA.structureofmRNA912、原核mRNA转译时，各个基因都有自己的SD序列、起始密码子、终止密码子，分别控制其合成的起始与终止，换言之，每个基因的翻译都是相对独立的。如E.coli，一个7000b的mRNA编码5种与Trp合成有关的酶

多基因共表达载体构建时，可利用SD序列，将几个基因串联92〔二〕

真核生物mRNA的构造1、真核生物mRNA5’端均具有m7GpppN帽子构造，无SD序列。帽子构造具有增强翻译的作用。假设起始AUG与帽子构造间的距离太近〔小于12个核苷酸〕，就不能有效利用这个AUG，会从下游适当的AUG起始翻译。当距离在17-80个核苷酸之间时，离体翻译效率与距离成正比。932、真核生物mRNA通常是单顺反子。真核mRNA具有“第一AUG规律〞，即当5’端具有数个AUG时，只有1个AUG为主要开放阅读框架的翻译起点。起始AUG具有2个特点：〔i〕AUG上游的-3经常是嘌呤，尤其是A。〔ii〕紧跟AUG的+4常常是G。起始AUG邻近序列中，以ANNAUGGN的频率最高。假设-3不是A，那么+4必须是G。无此规律的AUG，那么无起始功能。94OnceKozaksequenceEukaryoticmRNAusesamethylatedcaptorecruittheribosome.Oncebound,theribosomescansthemRNAina5’-3’directiontofindtheAUGstartcodon.Kozaksequenceincreasesthetranslationefficiency.Poly-Ainthe3’endpromotestheefficientrecyclingofribosomes9595KOZAK是一个女科学家

她研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子两端序列为：——G/N-C/N-C/N-ANNATGG——，如GCCACCATGG、GCCATGATGG时，转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。关于kozak序列的这篇文章发表在NucleicAcidsRes.1984上，该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体构建

96二、遗传密码氨基酸排列顺序由mRNA的核苷酸顺序决定。如果每2个核苷酸编码1个氨基酸,那么4种核苷酸只有16种编码方式。如果每3个核苷酸编码1个氨基酸,那么有64种编码方式,。如果4对1那么有256种,显然没必要。科学家们已用生物化学实验证实3个碱基编码1个氨基酸,称为三联体密码或密码子。97〔一〕遗传密码的破译美国科学家M.W.Nirenberg等人破译了遗传密码,于1968年获得诺贝尔生理医学奖.早在1961年，M.W.Nirenberg等人在大肠杆菌的无细胞体系中外加poly(U)模板、20种标记的氨基酸，经保温后得到了多聚phe-phe-phe，于是推测UUU编码phe。利用同样的方法得到CCC编码pro，GGG编码gly，AAA编码lys。如果利用poly〔UC〕，那么得到多聚Ser-Leu-Ser-Leu，推测UCU编码Ser，CUC编码Leu，因为poly〔UC〕有两种读码方式：UCU——CUC和CUC——UCU采用该方式，到1965年就全部破译了64组密码子。98〔二〕遗传密码的特点在64个密码子中有61个编码氨基酸，3个不编码任何氨基酸而起肽链合成的终止作用，称为终止密码子，它们是UAG、UAA、UGA，密码子AUG〔编码Met〕又称起始密码子。〔编码链上那么为TAG、TAA、TGA、ATG〕密码子：mRNA上由三个相邻的核苷酸组成一个密码子，代表肽链合成中的某种氨基酸或合成的起始与终止信号。〔1〕方向性：从mRNA的5’到3’99〔2〕连读性从起始密码子到终止密码子构成一个连续的阅读框架〔ORF〕〔不包括终止密码子〕。如果在阅读框中插入或删除一个碱基就会使其后的读码发生移码。两个基因之间或两个ORF之间可能会互相局部重叠〔共用局部序列〕。〔3〕简并性几种密码子编码同一种氨基酸称为密码子简并性。如GGN〔GGA、GGU、GGG、GGC〕都编码Gly，这4种密码子称为Gly的简并密码。只有Met和Trp没有简并密码。一般情况下密码子简并性只涉及第三位碱基。100问题：简并性的生物学意义？可以降低由于遗传密码突变造成的物种灾难试想，如果每种氨基酸只有1个密码子，如果一旦哪个氨基酸的密码子发生了单碱基的点突变，那么极有可能造成肽链合成的过早终止。例如，由于简并性的存在，不管第三位的U变成什么，都仍然编码Ala101〔4〕摇摆性密码子中第3位碱基与反密码子第1位碱基配对不一定完全遵循A-U、G-C的原那么，即密码子的第1、2位是严谨配对的，第3位严谨度低。密码子第3位和反密码子的第1位是摇摆位点，Crick称之为摇摆性。反密码子第1位的G可以与密码子第3位的C、U配对，U可以与A、G配对，另外反密码子中还经常出现罕见的I，可以和密码子的U、C、A配对，这使得该类反密码子的阅读能力更强。102103问题：细胞内有几种tRNA？遗传密码破译后，由于有61个密码子编码氨基酸，于是预测细胞内有61种tRNA，但事实上绝大多数细胞内只有50种左右，Crick提出的摇摆假说合理解释了这种情况。根据摇摆性和61个密码子，经过仔细计算，要翻译61个密码子至少需要31种tRNA，外加1个起始tRNA，共需32种。但在叶绿体和线粒体内，由于基因组很小，密码子少，叶绿体内就有30种左右tRNAs，线粒体只有24种。〔5〕通用性：密码子在不同物种间几乎是完全通用的。目前只发现线粒体和叶绿体内有例外情况。但是不同生物往往偏爱某一种密码子。104三、

核糖体核糖体又称核蛋白体，是蛋白质合成场所.标记各种氨基酸，注入大鼠体内，在不同时间取出肝脏，匀浆，离心别离各种亚细胞器，分析放射性蛋白的分布，证实蛋白质合成在核糖体上进展。就真核细胞而言，核糖体按其在细胞质中的位置分为游离核糖体〔合成细胞质蛋白〕和内质网核糖体〔合成分泌蛋白和细胞器蛋白〕。105106不管原核细胞还是真核细胞，一条mRNA可以同时被几个核糖体阅读，把同时结合并翻译同一条mRNA的多个核糖体称为多核糖体。107108〔一〕核糖体的构造与组成〔2021年诺贝尔化学奖〕核糖体是由核糖核酸〔rRNA〕和几十种蛋白质〔核糖体蛋白〕组成的巨大复合体。不同生物中核糖体的构造高度保守，尽管其rRNA和核糖体蛋白的一级构造有所不同，但其三级构造却惊人相似。核糖体是核酸和蛋白密切合作的表达！109每个核糖体是由大小两个亚基组成，每个亚基都有各自不同的rRNA和蛋白质分子核糖体的大亚基上有两个重要的位点：P位点是结合肽酰tRNA的肽酰基的位点，A位点是结合氨酰tRNA的氨酰基的位点。110〔二〕rRNA与核糖体蛋白的构造与功能1、rRNA的构造与功能构造：有大量茎环〔发夹〕构造，可能是核糖体的钢筋骨架。功能：〔1〕蛋白质合成的施工平台〔2〕参与tRNA与mRNA的结合mRNA先识别rRNA的特定序列并结合固定,然后tRNA再识别并固定到rRNA特定部位，其反密码子才与mRNA密码子配对。16SrRNA上有一段序列与原核mRNA上的SD序列相结合。111〔3〕在大小亚基的聚合中起作用〔4〕在翻译的校正和调控方面有重要功能〔如可结合调控因子〕总的来说，RNA分子似乎是整个核糖体的活性中心。1122、

核糖体蛋白的构造与功能构造：大多数核糖体蛋白呈纤维状〔可能起骨架作用〕，少数呈球状〔可能起生物功能〕。功能：(1)维持核糖体的构造(2)一些核糖体蛋白具有DNA构造〔Heilix—turn—Heilix模块〕；还有些真核核糖体蛋白具有DNA修复功能113四、蛋白质合成的机理真核和原核生物在蛋白质合成方面有共同之处,以下为蛋白质合成的一般过程。游离氨基酸在掺入肽链前须先活化以获得能量，每一种游离氨基酸须在专一的氨酰tRNA合成酶作用下与专一的tRNA相连〔称为装载〕，然后由tRNA将它带至核糖体的特定位点〔A位点〕并添加到正在合成的肽链C端。这种从游离氨基酸到形成氨酰tRNA的过程是氨基酸活化过程。114〔一〕氨酰tRNA合成酶：氨基酸活化和氨酰tRNA合成是蛋白质合成的第一步，由氨酰tRNA合成酶催化，该酶既能识别氨基酸，又能识别tRNA。1、活化在Mg2+存在下，氨酰tRNA合成酶首先识别并结合专一的配体氨基酸，然后氨基酸的羧基与ATP发生反响形成一个酸酐型的高能复合物〔氨酰AMP中间复合物〕，该中间复合物暂时结合在酶上。

酶/Mg2+氨基酸+ATP→氨酰AMP-酶+PPi115AMP1162、连接氨酰tRNA合成酶有专一的tRNA识别位点，因此游离tRNA就会识别并结合到氨酰AMP-酶复合物的活性部位，氨基酸被转移到tRNA的3端，其羧基与tRNA3端的自由-OH形成氨酰酯键，从而形成氨酰tRNA，此为高能化合物，其能量足以形成肽键。由于氨酰tRNA能量低于氨酰AMP，所以这一过程是自发的。

tRNA

+氨酰AMP-酶→氨酰tRNA+AMP+酶

117117aa-tRNAsynthase118ComplexofClassITyr-tRNAsynthetasewithtRNAtyr

Fig.Interactionsbetweentyrosyl-tRNAsynthetaseandtRNAtyr.(A)TheC-terminaldomain(orange)bindsintheelbowbetweenthelongvariablearmandtheanti-codonstemofthetRNA(redbackbone,greenbases).Theanti-codonstemloopinteractswithboththeC-terminaldomainandthe-helicaldomain(pink).ThetRNAmakesnocontactwiththecatalyticdomainofthesamesubunit(cyan).(B)Theunusualconformationoftheanti-codontripletinwhichAde-36isstackedonGua-34,whilePsu-35bulgesout.(C)Base-specificinteractionsofAsp-259fromthe-helicaldomainwithGua-34andAsp-423fromtheC-terminaldomainwithPsu-35.119mRNA120氨酰tRNA的去向由tRNA来决定，tRNA凭借自身的反密码子与mRNA上密码子相识别。结论：〔1〕氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成是蛋白质生物合成的第一步，活化和连接都发生在氨基酸的羧基上。〔2〕载体tRNA凭借自身的反密码子与mRNA上的密码子识别而把所携带的氨基酸送到肽链的一定位置上〔3〕遗传信息是通过mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子间碱基配对作用而传递。121氨酰tRNA合成酶：氨酰tRNA合成酶既能识别氨基酸，又能识别tRNA，从而使氨基酸与tRNA相对应，故把氨酰tRNA合成酶的双向识别功能称为第二遗传密码。122不同氨酰tRNA合成酶在分子量、氨基酸序列、亚基组成上差异较大。其识别氨基酸的机理尚不太清楚。一些氨基酸构造极其相似，尽管Ile与Val仅差一个甲基,但tRNAIle合成酶也能正确识别。偶尔也错误形成Val–tRNAIle，但是氨酰-tRNA合成酶都有一个校正位点，由于大小原因，只有Val–tRNAIle才能结合到校正位点，然后合成酶将Val又从tRNAIle上将其水解下来。123氨酰tRNA合成酶能正确识别和结合tRNA，一些氨酰tRNA合成酶识别tRNA上的反密码子，以及tRNA上的受体茎环〔acceptorstem〕。tRNA分子的突变与校正基因tRNA是一个万能接头：〔1〕有氨酰-tRNA合成酶的识别位点〔接头合成酶〕〔2〕3端-CCA上的氨基酸运载位点〔接头氨基酸，装载〕〔3〕有核糖体的识别位点〔将氨基酸运送到目的地〕〔4〕反密码子位点〔接头mRNA，验货并卸载〕124回复突变：突变型生物有时通过遗传物质的变化重新获得其原有表型，被回复的生物称为回复子。回复突变的原因很多，有一种回复突变是其基因上发生一个突变而引起，称为基因校正突变。大多数基因较正突变发生在tRNA基因上。125〔二〕蛋白质合成的一般过程可以分为三个阶段：起始、延伸、终止，分别由不同的起始因子、延伸因子和终止因子〔释放因子〕参与。126Fig14-14Overviewoftheeventsoftranslation/ribosomecycle127Polysome/polyribosome:anmRNAbearingmultipleribosomesEachmRNAcanbetranslatedsimultaneouslybymultipleribosomesFig14-15Apolyribosome1281、翻译起始〔1〕小亚基与mRNA结合〔2〕起始氨酰tRNA进入P位点，其反密码子与mRNA上的起始密码子AUG碱基配对。〔3〕大亚基与小亚基结合形成起始复合物。1292、延伸方向：mRNA5/3/新生肽：N/C/〔1〕就位：第二个氨酰tRNA通过密码子—反密码子的配对作用进入核糖体的A位点〔氨基位点〕。〔2〕转肽：在大亚基上肽酰转移酶作用下，A位点氨基酸的α-氨基亲核攻击P位点上氨基酸的羧基并形成肽键，结果两个氨基酸均连到A位点的tRNA上，该过程称为转肽作用，此时，P位点上卸载的tRNA从核糖体上离开。〔3〕移位〔translocation〕：核糖体沿着mRNA移动1个密码子位置，tRNA移位到P位点，A位点空出以便接纳下一个氨基酸。1303、

终止由于终止密码子不能结合任何氨酰tRNA，于是终止因子〔又称释放因子〕识别并结合到终止密码子上，接着肽转移酶的酯化酶功能转变成水解功能，将肽链从P位点tRNA上水解掉，核糖体释放掉mRNA并解体成大小亚基，翻译完毕。在翻译过程中除了核糖体大小亚基、mRNA和氨酰tRNA外，还需要GTP和许多蛋白辅助因子。这些辅助因子有的起催化作用，有的起改变和稳定构象作用。1314、翻译后加工一些肽链翻译完成后，能直接折叠成最终的活性形式，不需加工修饰。然而许多新生肽链需要翻译后加工或修饰,包括：〔1〕切除局部肽段〔蛋白酶〕，例如，酶原激活〔2〕在特定氨基酸残基侧链上添加基团〔共价修饰〕，例如糖基化、羟基化〔3〕插入辅因子，还有些单肽要聚合折叠成多亚基蛋白。132分子伴侣〔MolecularChaperones〕

定义：与新生肽链形成复合物并协助它正确折叠成具有生物功能构象的蛋白质，协助多肽链跨膜转运以及多亚基蛋白质的组装和解体，但它不属于新生肽链的组成局部。在原核表达时使用分子伴侣，减少包涵体的形成133包涵体-蛋白表达时的双刃剑包涵体是指细菌表达的重组蛋白在细胞内凝集，形成无活性、不溶性的固体颗粒。包涵体的存在常使得细胞破碎后很浑浊。

包涵体中一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等.

134包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进展折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法到达足够的溶解度等。

2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

135包涵体表达的有利因素1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以防止蛋白酶对外源蛋白的降解。

2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。

3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白别离，有利于别离纯化。

4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片别离。

136提高目的蛋白的可溶性的策略〔1〕在细胞中表达分子伴侣〔天然或异源〕，辅助新生肽链折叠，防止

肽链相互聚合；

〔2〕共表达折叠酶，催化共价键形成；

〔3〕通过降低培养温度和摇床速度来降低蛋白合成速度，以降低有聚

合倾向的中间体的浓度；

〔4〕选择中等强度或低强度的启动子代替强启动子，降低重组蛋白的合

成速度；

〔5〕选择适合的宿主菌株；

〔6〕表达含可溶性多肽或信号肽的重组蛋白，提高可溶性；

〔7〕蛋白质的可溶性往往与自身的氨基酸序列有关，因此可利用诱突

技术改变其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；

〔8〕诱导过程中参加化学物质，以增加渗透压或改变培养基的pH值。

137★在蛋白质折叠中有两类分子伴侣：〔1〕Hsp70s。Hsp70s是在折叠早期阶段起作用的分子伴侣家族。大量的Hsp70s。大量的Hsp70s单体结合在未折叠的疏水的正延伸肽段上。每一个Hsp70s有两个结合位点：未折叠多肽结合位点和ATP结合位点。多肽从Hsp70s上释放需要能量。内质网的Hsp70s还是多肽跨膜转运所必须的。〔2〕Hsp60s。一旦未折叠的多肽从Hsp70s上被释放，它就结合到一些Hsp60s上〔也称chaparonins,cpn60s〕。Hsp60s形成一个巨大的桶状构造，它有两个盖，未折叠蛋白进入桶中，Hsp60s帮助它形成正确的构造。分子伴侣还能帮助因各种胁迫而局部去折叠蛋白的重新折叠，如果不能重新折叠的话，分子伴侣就促进它的降解。138139伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程

伴侣素的主要作用——为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。140分子伴侣的应用及根底研究文献作用：促进原核表达蛋白的可溶性LuciaBanci,etal.MolecularchaperonefunctionofMia40triggersconsecutiveinducedfoldingstepsofthesubstrateinmitochondrialproteinimport.PNAS,2021,107:20210-20215StephanieMateriaetal.Clusterin(ApolipoproteinJ),aMolecularChaperoneThatFacilitatesDegradationoftheCopper-ATPasesATP7AandATP7B.J.Biol.Chem.,2021,286:10073-10083141翻译后加工的目的：〔1〕功能需要〔2〕定向转运的需要〔真核生物中尤为复杂，合成的蛋白要定向运输到细胞质、质膜、各种细胞器如叶绿体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体等〕。尽管原核生物与真核生物在蛋白质合成方面有许多相似之处，但也存在差异，这些差异正是一些抗生素治疗和研究应用的根底。

142非核糖体合成肽(NRP)MorganA.Wyatt,etal.StaphylococcusaureusNonribosomalPeptideSecondaryMetabolitesRegulateVirulence.Science,2021,329:294-296HervéRoyandMichaelIbba.Bridgingthegapbetweenribosomalandnonribosomalproteinsynthesis.PNAS,2021,107:14517-14518143Aminoacyl-tRNAsynthetases(aaRSs)aretheenzymesnormallyrespons