埃博拉病毒实验活动风险评估报告

埃博拉病毒实验活动风险评估报告一、生物因子（一）一般特性埃博拉病毒（Ebolavirus）属丝状病毒科，为不分节段的单股负链RNA病毒，是一种导致急性出血性传染病——埃博拉出血热（EbolaHemorrhagicFever，EHF）的病原体。埃博拉出血热病死率高，可达50%~90%。该病于1976年在非洲首被发现，目前主要在乌干达、刚果、加蓬、苏丹、科特迪瓦、南非、几内亚、利比里亚、塞拉利昂等非洲国家流行。2014年2月初，几内亚东南部马桑达省出现发热死亡病例，周边省份和首都地区随后也发现类似病例。3月22日，马桑达地区采集的12份疑似病例的样本在法国进行了检测并得到最终确认，从6例病人样本中检测出埃博拉病毒，并与扎伊尔型有较强的同源性，随后疫情持续扩散，至7月份，疫情已经在几内亚、利比里亚和塞拉利昂三个国家内蔓延，并波及尼日利亚。截至2014年8月4日，上述四个国家的埃博拉出血热病例数累计已达1211例，其中死亡数为932例。病例分布如下，几内亚有495例，其中确诊病例有351例，疑似病例有133例，可疑病例有11例，死亡数为363例；利比里亚有516例，其中确诊病例有143例，疑似病例有252例，可疑病例有121例，死亡数为282例；塞拉利昂有691例，其中确诊病例有576例，疑似病例有49例，其中可疑病例有66例，死亡数为有286例；尼日利亚有9例，疑似病例有2例，可疑病例有7例，死亡数为1例，无确诊病例。埃博拉病毒呈长丝状体，可呈杆状、丝状、“L”形等多种形态。毒粒长度平均为lOOOnm，直径约lOOnm。病毒有脂质包膜，包膜上有呈刷状排列的突起，主要由病毒糖蛋白组成。埃博拉病毒基因组是不分节段的负链RNA，大小为18.9kb，编码7个结构蛋白和1个非结构蛋白。编码的蛋白包括包膜糖蛋白、核衣壳蛋白、基质蛋白VP24和VP40，2种非结构蛋白VP30和VP35，以及病毒多聚酶L。其基因排列顺序为:3’引导区-NPVP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’末端区。（二）来源1976年，在同时发生的两起疫情中首次发现埃博拉病毒，一起发生在刚果民主共和国靠近埃博拉河的一个村庄，另一起出现在苏丹的一个边远地区。目前发现的病毒感染病例主要发生在乌干达、刚果、加蓬、苏丹、科特迪瓦、南非、儿内亚、利比里亚、塞拉利昂等非洲国家。目前认为埃博拉病毒的自然宿主为狐蝠科的果蝠，尤其是锤头果蝠、富氏前肩头果蝠和小领果蝠，但其在自然界的循环方式尚不清楚。感染埃博拉病毒的人和非人灵长类动物为该病传染源。人主要通过接触病人或感染动物的体液、分泌物和排泄物等而感染。（三）传染性埃博拉病毒为高传染性病毒，病死率最高可达50%～90%。病人在潜伏期内没有传染性，一旦开始出现症状，就具有传染性。（四）传播途径接触传播是埃博拉病毒最主要的传播途径。可以通过接触病人和被感染动物的各种体液、分泌物、排泄物及其污染物而感染。病人感染后血液中可维持很高的病毒含量，医护人员在治疗、护理病人，或处理病人尸体过程中，如果没有严格的防护措施，容易受到感染。医院内传播是导致埃博拉出血热暴发流行的重要因素。据文献报道，埃博拉出血热患者的精液中可分离到病毒，故存在性传播的可能性。有动物实验表明，埃博拉病毒可通过气溶胶传播。虽然尚未证实有通过性传播和空气传播的病例发生，但应予以警惕，做好防护。（五）易感性人群普遍易感，主要集中在成年人，因暴露或接触机会多。易患人群为医务人员、与患者密切接触的家人或其他人、在葬礼上按照礼仪与死者尸体有直接接触的送葬者和与热带雨林的死亡动物有直接接触的猎人。（六）潜伏期潜伏期为2～2ld，一般为5～12d。尚未发现潜伏期有传染性，病人出现症状的时候具有传染性。（七）剂量—效应关系尚不清楚病毒的这种特性。但该病毒具有高度感染性，需要做好严密防护，在BSL-3实验室操作时参照SARS冠状病毒的个人防护要求，特别要注意避免接触未灭活的生物样本。（八）致病性1.临床表现患者急性起病，高热、畏寒、极度乏力、头痛、肌痛、咽痛、结膜充血及相对缓脉。随后可出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻、黏液便或血便、皮疹等表现。重症患者可出现神志改变,如嗜睡、谵妄等症状,并可出现不同程度的出血表现，包括鼻、口腔、结膜、胃肠道、阴道、皮肤出血或咯血、血尿等,可出现低血压、体克等。同时,可并发心肌炎、肺炎和其他多脏器受损。2.病理特征丝状病毒具有嗜细胞性,主要是网状内皮系统细胞、成纤维细胞和间质组织细胞,尤其是肝实质细胞。病毒在全身各组织器官中分布,肝、肾、脾、肺中含量最高。病理剖检变化因毒株不同而有很大差异。常见的病理改变是皮肤、黏膜、脏器的出血,多器官可以见到灶性坏死,肝细胞点、灶样坏死是本病的典型特点,可见小包涵体和凋亡小体。（九）变异性埃博拉病毒可分为扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型、塔伊森林型和莱斯顿型。除莱斯顿型对人不致病外，其余四种亚型感染后均可导致人发病。不同亚型病毒基因组核苷酸构成差异较大，但同一亚型的病毒基因组相对稳定。（十）稳定性埃博拉病毒在常温下较稳定，对热有中等度抵抗力，56℃不能完全灭活,60℃灭活病毒需要1h;紫外线照射2min可使之完全灭活。对化学药品敏感，乙醚、去氧胆酸钠、β-丙内酯、福尔马林、次氯酸钠等消毒剂可以完全灭活病毒的感染性；钴60照射、γ射线也可使之灭活。埃博拉病毒在血液样本或病尸中可存活数周；4℃条件下存放5周可使其感染性保持不变，8周滴度降至一半。-70℃条件下可长期保存。（十一）预防和治疗1．预防预防要针对传染源、传播途径、易感人群三个环节，采取以管理和控制传染源、预防控制医院内传播为主的综合性防治措施。(1)控制传染源对疑诊病例和病人，应收入负压病房进行隔离治疗。对其排泄物及污染物品均严格消毒。(2)切断传播途径严格规范污染环境的消毒工作，严格标本采集程序，病毒的分离和培养应在BSL-4实验室、动物感染实验在ABSL-4实验室、未经培养的感染材料的操作在BSL-3实验室、灭活材料的操作在BSL-2实验室、无感染性材料的操作在BSL-1实验室中进行。按照《医院感染管理规范》的要求做好院内感染控制。(3)保护易感人群加强个人防护，使用防护装备。目前尚无获准使用的埃博拉疫苗，有几种疫苗正在进行临床试验，但目前尚无任何疫苗可用于临床。2．治疗目前尚缺乏特效治疗方法，主要是对症和支持治疗。注意水、电解质平衡，预防和控制出血，控制继发感染，治疗肾功能衰竭和出血等并发症。危重病例需要加强支持性护理，病人往往会脱水，需要以电解质溶液进行静脉输液或口服补液。尚没有特殊的治疗方法，新的药物疗法正在进行评估。（十二）事故分析迄今为止，国内外还未报道实验室感染事件。一旦发生此类事件，应按照体系规定程序进行报告。对开展埃博拉病毒检测、科研工作的实验室进行严格控制，确保实验室生物安全。从事埃博拉病毒科研、检测的实验室应加强生物安全管理，应建立健全烈性传染病病原管理组织；制订和完善埃博拉病毒实验室生物安全的技术操作规范；加强可能暴露于埃博拉病毒或潜在感染性材料的相关业务人员的生物安全知识培训和风险意识教育；切实落实各项管理制度，预防和控制实验室等造成埃博拉病毒的感染和传插的渠道；建立实验室工作人员可疑症状报告的制度，并保证他们能及时被定点专科医院收治。二、风险评估与风险控制(一）实验活动BSL-3实验室从事埃博拉病毒的核酸检测与血清学检测。1.埃博拉病毒的核酸检测的风险和控制措施（见表8-37）表8-37埃博拉病毒的核酸检测的风险和控制措施序号实验操作可能风险发生概率发生范围控制措施残留风险标本处理1.标本转移至生物安全柜离心管掉落破裂或破碎，感染性物质溅出，同时可能产生气溶胶低生物安全柜内实验操作人员在标准防护的基础上，要做好接触防护和呼吸道防护。标本或血清处理时要动作轻柔，应事先在操作台下面铺新鲜配制的含有5000mg/L有效氯的次氯酸钠纱布。一旦发生上述意外，马上将污染的纱布或纸弃入含5000mg/L有效氯的次氯酸钠的消毒缸内并立即消毒台面及更换新的纱布或吸水纸低2.核酸提取1.液体溅出，离心管滑落，打翻标本2.标本转移时，吸头漏液3.加样时，感染性液体溅出，污染离心管外部、手臂或生物安全柜台面4.产生气溶胶低生物安全柜内或离心机在操作时，动作要小心，以防开盖时离心管滑落、打翻或溅出使用移液器时，确保吸头与移液器连接紧密样品打开前进行短暂离心，去除样品管盖上的残留，避免开盖时样品溅出使用带滤芯的吸管，动作要轻缓。若滴落在生物安全柜台面，应及时消毒处理，以5000mg/L有效氯的次氯酸钠纱布、75%的酒精纱布处理。若皮肤暴露于感染材料，应立即用清水或肥皂水彻底清洗，或用0.5%碘伏消毒液、75%酒精氯己定擦拭消毒，使用清水或肥皂水彻底清洗；黏膜应用大量清水冲洗或0.05%碘伏冲洗。若手接触感染材料，用75%的酒精消毒后脱去最外层的手套，换一副新手套，并用75%的酒精纱布擦拭管壁，将污染的纱布放在生物安全柜内的垃圾袋内，封口后移出生物安全柜，进行高压处理5.实验室采用带有安全套盖的离心套筒，如离心过程中发生收集管破裂时，应关闭电源，在生物安全柜内处理相关感染性物质，彻底清洁和消毒离心机套桶。如果在不带有安全套筒的离心机操作，离心过程中发生收集管破裂时，应关闭电源并且保持离心机盖子关闭30min。如果在机器停止运行后发生了破裂时，离心机盖应立即关闭并保持30min，并及时通知本实验室生物安全员采取相应措施。2.埃博拉病毒的血清学检测的风险和控制措施（见表8-38）表8-38埃博拉病毒的血清学检测的风险和控制措施序号实验操作可能风险发生概率发生范围控制措施残留风险1.标本处理1.标本转移至生物安全柜离心管掉落破裂或破碎，感染性物质溅出，同时可能产生气溶胶低生物安全柜内实验操作人员在标准防护的基础上，要做好接触防护和呼吸道防护。标本或血清处理时要动作轻柔，应事先在操作台下面铺新鲜配制的含有5000mg/L有效氯的次氯酸钠纱布。一旦发生上述意外，马上将污染的纱布或纸弃入含5000mg/L有效氯的次氯酸钠的消毒缸内并立即消毒台面及更换新的纱布或吸水纸低2.对标本或血清进行稀释、震荡产生气溶胶和溅出液体低生物安全柜内稀释与震荡时要动作轻柔，应事先在操作台下面铺新鲜配制的含有5000mg/L有效氯的次氯酸钠纱布。一旦发生上述意外，马上将污染的纱布或纸弃入含5000mg/L有效氯的次氯酸钠的消毒缸内并立即消毒台面及更换新的纱布或吸水纸低2.抗原抗体反应与结果测定过程1.吸取稀释后标本或血清至微孔或抗原片标本滴落台面或抽吸的过程，形成气溶胶低生物安全柜内使用带滤芯的吸管，动作要轻缓。若滴落在生物安全柜台面，应及时消毒处理，以5000mg/L有效氯的次氯酸钠纱布、75%的酒精纱布处理。若皮肤暴露于感染材料，应立即用清水或肥皂水彻底清洗，或用0.5%碘伏消毒液、75%酒精氯己定擦拭消毒，使用清水或肥皂水彻底清洗；黏膜应用大量清水冲洗或0.05%碘伏冲洗。若手接触感染材料，用75%的酒精消毒后脱去最外层的手套，换一副新手套，并用75%的酒精纱布擦拭管壁，将污染的纱布放在生物安全柜内的垃圾袋内，封口后移出生物安全柜，进行高压处理低2.移至孵箱孵育加样后微孔板或抗原片跌落，形成气溶胶低实验室污染区将微孔板或抗原片置湿盒中，封口膜妥善密封，转移时使用转移托盘低3.微孔板或抗原片洗涤洗涤后的液滴滴落台面或抽吸的过程形成气溶胶低生物安全柜内使用带滤芯的吸管，动作要轻缓。若滴落在生物安全柜台面，应及时消毒处理，以5000mg/L有效氯的次氯酸钠纱布、75%的酒精纱布处理。若皮肤暴露于感染材料，应立即用清水或肥皂水彻底清洗，或用0.5%碘伏消毒液、75%酒精氯己定擦拭消毒，使用清水或肥皂水彻底清洗；黏膜应用大量清水冲洗或0.05%碘伏冲洗。若手接触感染材料，用75%的酒精消毒后脱去最外层的手套，换一副新手套，并用75%的酒精纱布擦拭管壁，将污染的纱布放在生物安全柜内的垃圾袋内，封口后移出生物安全柜，进行高压处理低4.酶标仪检测吸光度或荧光显微镜观察移动过程跌落导致溢出或形成气溶胶低实验室污染区放置托盘中，移动时轻缓，注意安全。此时微孔板或抗原片中残留感染性病毒的可能已极低。溢出或滴落时，停止实验，先用一块布或纸巾盖上，再把消毒剂倒到上面，实验人员先退出实验室，至少静置30min，然后才可把布和纸巾等物品清理走。另应注意反应液的化学危害或抗原片跌落破裂导致的物理伤害低（二）设施设备设施设备中，生物安全柜、水浴箱、离心机、振荡器、冰箱、高压灭菌器的可能风险以及控制措施见表8-39。表8-39设施、设备中的风险和控制措施仪器名称可能风险发生可能性后果描述控制措施生物安全柜气流异常可能性低对实验人员及实验室的高度危险操作培训，设备定期维护。使用时，观察窗不要抬得过高；柜内尽量少放仪器和物品，不要阻塞后面气口处的空气流通；禁止在柜内使用酒精灯；在柜内的所有工作都要在工作台中央或后部进行，并且通过观察窗能看见柜内的操作；尽量减少操作者后面的人员走动，操作者不要频繁移动及挥动手臂以免破坏定向气流；前面的空气栅格不要被吸管或其他材料挡住；生物安全柜的风扇在工作开始前及操作结束后至少要再运行5min离心机离心管发生破裂，气溶胶释放可能性低人员接触污染配备离心机有安全套筒，可转移到生物安全柜内处理振荡器产生气溶胶、泄漏和容器破裂可能性低人员样品接触污染必须使用塑料的器皿，因为玻璃可能会破裂而释放出感染性物质，而且可能伤及操作者。在操作结束后，容器应在生物安全柜里才能重新开启水浴箱产生气溶胶、水浴箱温度不准可能性低病毒灭活不彻底，人员接触污染操作轻柔，样本密封后放入水浴箱，样本开盖操作在生物安全柜内进行；水浴箱定期进行校准冰箱保存管泄漏可能性极低人员样品接触污染操作培训，做好个人防护高压灭菌器人员接触高温部位，发生烫伤可能性中等人员发生烫伤操作培训，做好个人防护（三）人员1．健康监测和健康状况评估实验人员、辅助人员、后勤保障人员上岗前应建立个人健康档案，进行定期的健康体检和相应的免疫接种。人员的健康状况应当符合实验室的安全工作要求。从事埃博拉病毒研究的实验室工作人员必须在身体状况良好的情况下，才能进入BSL-3实验室工作。出现下列情况时不能进入：患发热性疾病；感冒、上呼吸道感染，或其他导致抵抗力下降的情况；妊娠；已经在实验室控制区域内连续工作4h以上,或其他原因造成的疲劳状态；心理素质不稳定的也尽量避免进入实验室；未经充分专业操作技能培训的人员。埃博拉病毒实验人员的监测期从开始进行实验当日开始，直至实验结束后3周。期间应每日早晚测量体温并观察相应症状。若操作者或其所在实验室的工作人员在此期间出现发热、出血、头疼、呕吐、腹泻等类似症状，则应被视为可能发生实验室感染，应立即报告实验室负责人。采取早发现、早报告、早隔离、早治疗以控制管理传染源为主的综合性防治措施，并在2h内报告所在地的县级人民政府卫生主管部门。对疑似感染者，采取严格的隔离防护措施，送至指定医院就诊，并做好转运过程的安全隔离和防护、消毒工作。另外措施有实验活动前采集本底血清样本．实验活动期间每天测体温，必要时采集血液样本进行前后对比检测，以确定是否感染。人员资质和培训实验人员、辅助人员、后勤保障人员上岗前均须接受严格的生物安全，以及相关操作的技术培训，包括实验室设施、设备、个体防护、操作等培训。同时，必须熟悉和严格遵守实验室的管理要求。人员资质和培训的风险和控制措施见表8-40。表8-40人员资质和培训的风险和控制措施潜在风险因素发生可能性后果严重性控制措施实验人员技术水平技术培训不足或操作不熟练导致误操作严重实验人员需接受相关技术培训并考核合格后方能上岗；定期进行相关培训及演练人员健康水平实验人员身体状况不佳或患有基础疾病严重实验室工作人员每年参加体检，预留本底血清标本；实验人员进入BSL-3实验室前需测量体温，体温高于37℃者不能进入未经授权人员未经授权人员进入BSL-3实验室严重进入BSL-3实验室须得到相关部门和实验室负责人的批准，应详细登记出入时间，并保证两名以上的人员同时进入（四）意外事件、事故带来的风险埃博拉病毒的安全防护重点是实验操作过程中避免与感染材料直接接触,尽量减少气溶胶的产生和对相关人员的吁吸道的保护，在标准防护的基础上，要做好接触防护和呼吸道防护。1．临床标本的处理疑似埃博拉病毒感染的病人的分泌物、排泄物和血液标本等这些标本当中有可能含活病毒，但浓度不详。对此类临床标本的操作都必须在实验室生物安全柜内操作，实验操作人员按三级防护级别进行个人防护。2．涉及活病毒的操作病毒培养在BSL-4实验室、动物感染实验在ABSL-4实验室、未经培养的感染材料的操作在BSL-3实验室中进行。3．已灭活的病毒或标本的操作已灭活的病毒或血清标本等，用于病毒特异性核酸、抗原、抗体检测实验时，可在BSL-2级实验室进行操作。实验操作人员按二级防护级尽量使用塑料材质的实验物品，避免使用尖锐物品和利器。必须使用时应倒放在耐扎的容器内，使用后收集在特定的带盖的锐器容器内保存至最后消毒处理或毁掉。禁止将使用后的一次性针头重新套上针头套。严格禁止用手直接接触使用后的针头、刀片等锐器。禁止徒手处理破损或打碎的玻璃器材。对实验室的台面，应当对其锐角进行处理，如加装桌角保护器或对桌角进行打磨等，使桌角保持光滑，避免割伤皮肤。实验室操作后的消毒措施涉及临床标本和活病毒的实验操作，在实验完毕后用含0.5%有效氯的次氯酸钠消毒剂溶液擦拭工作台面、生物安全柜内壁及台面，实验器材表面用70%酒精擦拭后移出生物安全柜。废弃物在实验室内121℃高压处理30min后才允许运出实验室。在BSL-2实验室中进行核酸扩增、抗体检测等实验时，为了确保安全，实验过程中产生的废液和使用过的耗材等都必须用含10%有效氯的次氯酸钠消毒液浸泡30min后，才允许运出实验室并存放在指定的存放点进行集中处理。（五）其他风险控制其他风险主要包括对化学、物理、辐射、电器和水灾、火灾等自然灾害等引起的风险。化学风险应熟知实验涉及的试剂的化学品安全说明书，本实验过程中可能接触免疫学检测中的酸、碱、抗原片制备过程中的固定试剂，应注意操作轻缓，防止溅落而接触皮肤。如发生皮肤接触，应停止实验，在做好紧急处置后，撤离实验区，用大量水冲洗，如有需要，应就医。2．物理风险如破损器皿的刺伤、使用锐器不当造成的扎伤、实验室台面的锐角割伤等。在BSL-3实验室中，各实验区空间一般较为狭小，在放置了各种实验设备、实验人员穿戴两层防护用品后，行动难以自如，存在被绊倒的可能。如果实验台的台面和其他部位存在锐角设