DB13-T 1767-2013 苹果品种 DNA 指纹鉴定

65.020.20B

05DB13

指纹鉴定河北省质量技术监督局

DB13/T

1767—2013前言本标准按照GB/T

1.1—2009给出的规则起草。本标准由河北省林业厅提出。本标准起草单位：河北农业大学。魏姗姗、甄红伟、王瑞霞。IDB13/T

1767—2013苹果品种

指纹鉴定1

范围本标准规定了苹果品种DNA指纹鉴定的方法及判定标准。本标准适用于苹果品种鉴定及河北省苹果品种DNA2

原理不同苹果品种由于遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可经过PCR扩增、电泳分离、显色程序绘制的DNA指纹图谱加以区分，从而对不同品种进行鉴定。从苹果幼苗、扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（或通过DNA分析仪、测序仪进行分离），并通过染色显示DNA指纹谱带类型。3

仪器设备及试剂苹果品种DNA指纹鉴定所需仪器设备及试剂名单见附录A。4

溶液配制苹果品种DNA指纹鉴定相关溶液配制方法见附录B。5

鉴定方法5.1 样品准备5.1.1 取样量每份送检样品至少检测3个个体，每个个体至少1g，对一致性差的样品应至少检测5个个体。5.1.2 品种比较方式a)

成对品种的比较送检样品提供两份，一份为待检品种，一份为对照品种。将待检品种与对照品种直接进行成对比较。杂交后代需提供母本与父本的样品。b)

品种与

DNA

指纹库入库品种的比较

DNA

似或相同的品种作为待检品种的近似品种，然后将待检品种与近似品种直接进行成对比较。5.2 DNA

提取1反应组分原浓度终浓度反应体积

μLddHO13.3510×1×2MgCl25mmol/L2.5mmol/L2dNTP2.5mmol/L0.15mmol/L1.2

酶5U/μL1U0.2引物20μmol/L0.25μmol/L0.25DNA30~50ng/μL1.5~2.5

ng/μL1DB13/T

1767—20135.2.1 宜采用改良的

CTAB

法。取

干净叶片置入

500μLDNA

并加

1mL

洗涤液及

5min，于

4℃，12000

g

离心

8min

后，洗涤一次，弃上清，再加

700μL

65℃水浴

后于室温冷却4

于室温

12000

g

离心

离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混匀后室温静置

5min，室温

12000g

离心

2

淀

30

g

离心

10min，将所得沉淀风干后溶于

水中，置

5.2.2 其它保证

质量的方法也可采用，应用前需要通过微量紫外分光光度计进行

DNA

质量与浓度检测。5.3 PCR

扩增5.3.1 SSR

扩增基本核心引物名单见附录C。5.3.2 反应体系反应液体积为20μμ表1 PCR

反应体系5.3.3 反应程序5.3.3 反应程序存。5.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳5.4.1 清洗玻璃板用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂上0.5

相污染。5.4.2 组装电泳板待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。2DB13/T

1767—20135.4.3 灌胶在100

mL

4

μL，迅速混匀后灌胶。待胶流动到下部，在上部轻轻插入梳子，使其聚合至少lh以上。灌胶过程中防止出现气泡。5.4.4 预电泳在正极槽中加入1×TBE缓冲液600

mL，在负极槽(上槽)加入预热至65℃的I×TBE缓冲液600

mL，拔出梳子。90W恒功率预电泳10

5.4.5 变性在20μL

μL6×

95℃变性5min，4℃冷却10

min以上。5.4.6 电泳μ泳至上部的指示带(二甲苯青)到达胶板的中部(约40

紧贴在长板上。5.5 银染5.5.1 银染流程图固定液中轻轻晃动固定液中轻轻晃动

3

双蒸水快速漂洗

1

次，不超过

10

s银染

10~15

双蒸水快速漂洗

1

次，不超过

10

s显影液中轻轻晃动至带纹出现双蒸水快速漂洗

1

次，不超过

30

s定影

固定液中定影

5

双蒸水漂洗

1

6

结果及判定3DB13/T

1767—20136.1 数据表示谱带记录方式:每个核心引物的所有谱带按扩增片段从大到小的顺序编号，用二位代码描述(依次为01、02

..….)，并确定代表每条谱带的一套标准品种。每个待测品种在每个引物位点上的谱带号用四位代码描述，参照标准品种确定待测品种的谱带号。示例1：在一个核心引物上仅有一条谱带

02，品种在该引物位点的谱带代码为

示例2：在一个核心引物上有两条谱带

02

和03，品种在该引物位点的谱带代码为

6.2 检测及判定标准6.2.1 先用

17

对基本核心引物检测，获得待测品种在

个引物位点的

指纹谱带数据，利用

17个位点的

指纹谱带数据进行品种间比较。亲缘关系较近难以区分时可附加

17

a)

品种间差异位点数≥2，判定为不同品种；b)

品种间差异位点数＝1，判定为相近品种；c)

品种间差异位点数＝0，判定为相同或极近似品种。6.2.2 对

b

和

c

17

34

个位点的

指纹谱带数据进行品种间比较：a)

品种间差异位点数≥2，判定为不同品种；b)

品种间差异位点数＝1，判定为相近品种；c)

品种间差异位点数＝0，判定为相同或极近似品种。6.3 鉴定报告鉴定报告书格式见附录D。4DB13/T

1767—2013AA附 录 A（规范性附录）仪器设备及试剂A.1 仪器设备A.1.1 PCR核酸扩增仪:规格为96孔;A.1.2 序列分析电泳槽;A.1.3 高压电泳仪:规格为3000

V

,

mA,

W

;A.1.4 水平摇床;A.1.5 胶片观察灯;A.1.6 电子天平;A.1.7 微量加样器;A.1.8 磁力搅拌器;A.1.9 高速离心机A.1.10 微量紫外分光光度计A.1.11 高压灭菌锅;A.1.12 pH酸度计。A.2 试剂所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。A.2.1 乙二胺四乙酸二钠;A.2.2 Tris碱;A.2.3 盐酸;A.2.4 氢氧化钠;A.2.5 10

×

Buffe:缓冲液;A.2.6 四种脱氧核苷酸:4

×

dNTP;A.2.7 Taq

DNA聚合酶;A.2.8 SSR引物;A.2.9矿物油;5DB13/T

1767—2013A.2.10 去离子甲酞胺;A.2.11 澳酚蓝;A.2.12 二甲苯青FF;A.2.13 甲叉双丙烯酰胺;A.2.14 丙烯酰胺;A.2.15 硼酸;A.2.16 脲素;A.2.17 亲和硅烷:97

%;A.2.18 剥离硅烷:2%二甲基二氯硅烷;A.2.19 无水乙醇;A.2.20 四甲基乙二胺(TEMED)

;A.2.21 过硫酸铵;A.2.22 冰醋酸;A.2.23 硝酸银;A.2.24 甲醛溶液:37

%。6DB13/T

1767—2013BB附 录 B（规范性附录）溶液配制B.1 DNA提取溶液的配制B.1.1 0.5mol/L

EDTA溶液186.lg NaO

溶于

800

水中，用固体

NaOH

调

至

8.0，定容至

，高压灭菌。B.1.2 1

mol/L

碱溶于适量水中，加

HCI

调

至

8.0

500

，高压灭菌。B.1.3 洗涤液100

8.

0;

50

1M

NaC;l

巯基乙醇;

B.1.4CTAB

提取缓冲液100

（），20

，，2%

（）的

β-巯基乙醇()B.1.5 酚/氯仿/异戊醇25：24：1。B.1.6TE缓冲液1

，0.5

1

，加

HCI

调

至

8.0，定容至

。B.1.7TE缓冲液2

，0.5mol/L1

，0.5

HCI

100

，定容至

500

。B.1.8 5

mol/L

NaCI溶液146g

固体

NaCI

溶于水中，加水定容至

500

。B.2 PCR扩增溶液的配制B.2.1 dNTP用超纯水分别配制

A、G、C、T

终浓度

100

的储存液。各取

混合，用超纯

定容至终浓度

each

的工作液。也可直接购买浓度

的工作液。B.2.2 SSR引物用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均

的储存液，等体积混合成

的工作7DB13/T

1767—2013液。注:干粉配制前应首先快速离心。B.2.36×加样缓冲液去离子甲酞胺

49

，0.5

的

溶液(pH8.0)1

，澳酚兰

0.125g，二甲苯青

0.125g。B.3 变性聚丙烯酞胺凝胶电泳溶液的配制B.3.1 40%PAGE胶丙烯酞胺

190g

和甲叉双丙烯酚胺

定容至

。B.3.2 4.5%PAGE胶尿素

450g，10

×

缓冲液

，

胶

，定容至

。B.3.3 Bind缓冲液49.75

无水乙醇和

250μL

冰醋酸，加水定容至

50

。B.3.4亲和硅烷工作液在

缓冲液中加入

5μL

原液，混匀。B.3.5剥离硅烷工作液2%二甲基二氯硅烷。B.3.6 25%过硫酸铵溶液0.25g

过硫酸铵溶于

1

超纯水中。B.3.7 10×TBE缓冲液

碱

108g，硼酸

55g，0.5mol/L

溶液

37

，定容至

。B.3.81×TBE缓冲液10×TBE

缓冲液

，加水定容至

。B.4 银染溶液的配制B.4.1固定液100

冰醋酸，加水定容至

。B.4.2 染色液2g

硝酸银，加水定容至

1000

。B.4.3 显影液1000mL蒸馏水中加入30

g氧氧化钠和5

mL甲醛。8标记位点染色推荐正向引物序列（）反向引物序列（）CH03g121ICH02b102ICH03g073I4ICH03a095ICH03d126ICH02a047ICH01c068ICH01f03b9ICH02a0810ICH02d08ICH01F0212ICTGGTTTGTTTTCCTCCAGCCH05c0413ICH03d0814ICH02c0915ICH05a0416ICH01h0117IHi02c071CH02c02a2MS14h033CH04e024CH05f065CH03d076CH04e057CH01f098CH01h029CH02B03b10CH04g07CH04d0212CH03a0813CH03g041415CH04f1016CH05g0317注：I型标记含首先采用的17对引物，II型标记含候补采用的17对引物。DB13/T

1767—2013CC附 录 C（规范性附录）基本核心引物名单9DB13/T

1767—2013DD附