《第05讲 动物细胞工程》预习讲义

学而优·教有方PAGEPAGE1第05讲动物细胞工程【学习目标】1.阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织，分散成单个细胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。动物细胞培养是动物细胞工程的基础。2.阐明动物细胞核移植一般是将体细胞核移入一个去核的卵母细胞中，并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的过程。3.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。4.概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术。5.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。【基础知识】一、动物细胞工程1.动物细胞培养的条件营养①无机物：无机盐等。②有机物：糖类、氨基酸、维生素、血清等。无菌、无毒环境①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。②在无菌环境下进行操作。③定期更换培养液，以便清除代谢物。温度、pH和渗透压①温度：哺乳动物细胞多以36.5±0.5℃为宜。②pH：多数动物细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。气体环境①95%的空气和5%的CO2混合气体。②保证细胞代谢所必须的氧气。③维持培养液的pH值。2.动物细胞培养的过程（1）原代培养的过程3.传代培养的过程①吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。②向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。③置37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，2~5min后把培养瓶放在倒置显微镜

下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。④吸出消化液，向瓶内加入Hanks液少量，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液，终止消化。⑤使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。⑥用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养。⑦细胞培养

换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。归纳总结1.原代培养:原代培养:即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。有几方面含义:①培养物一经接种到培养器皿(瓶)中就不再分割，任其生长繁殖;②原代培养中的"代"并非细胞的"代"数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞;③原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿。2.传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。为了保持细胞正常的二倍体核型，传代培养一般只培养到10代。3.细胞贴壁和接触抑制①细胞贴壁是指体外培养的细胞贴附在瓶壁生长的现象；接触抑制是指当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖的现象。②细胞贴壁生长对培养瓶的要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。③打破接触抑制现象的方法是将贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。4.掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不宜从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。5.掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时，消化时间应缩短，过低时细胞消化时间相对延长。6.动物细胞培养和植物组织培养的比较项目动物细胞培养植物组织培养理论基础细胞增殖植物细胞的全能性培养前处理无菌；用机械的方法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理，使组织分散成单个细胞。无菌、离体取材动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织。植物幼嫩的部位或花药等培养基性质液体培养基固体培养基培养基成分糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。水、矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素和琼脂等。结果细胞培养产生大量细胞，不形成新个体。可产生大量的细胞，也可产生新个体应用人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产。快速繁殖、作物脱毒、细胞产物的工厂化生产和单倍体育种等。相同点①都需人工条件下的无菌操作；②都需要适宜的温度、pH等条件；③都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂。二、干细胞培养及其应用1.干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(ES细胞)和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类:全能干细胞(TSC)、多能干细胞和单能干细胞(专能干细胞)。干细胞(StemCell)一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。2.干细胞的培养和应用早期胚胎干细胞骨髓、脐带血干细胞等体细胞(如成纤维细胞等)具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织或器官甚至个体的潜能。具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力能诱导分化成类似胚胎干细胞的细胞分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等造血干细胞用于治疗白血病，神经干细胞用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等治疗镰状细胞贫血、阿尔茨海默病、心血管疾病等3.胚胎干细胞的应用体外诱导小鼠成纤维细胞→诱导多能干细胞→定向诱导→多种体细胞→临床治疗多种疾病。三、动物细胞融合技术概念使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术方法聚乙二醇法、电融合法、灭活病毒诱导融合法等原理细胞膜具有一定的流动性结果形成具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞意义突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，为制造单克隆抗体开辟了新途径四、单克隆抗体及其应用1.单克隆抗体制备的原理①B淋巴细胞特点：一种B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。②骨髓瘤细胞特点：能在体外大量增殖。③杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。2.单克隆抗体的制备过程3.单克隆抗体的应用①作为诊断试剂诊断疾病：②作为载体运载药物；③作为药物治疗疾病。归纳总结1图中给小鼠注射特定的抗原蛋白，其目的是刺激机体发生免疫应答，从而产生特定的B淋巴细胞。2.若仅考虑细胞的两两融合，在获取杂交瘤细胞的过程中，筛选淘汰的细胞有未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(B－B融合细胞、瘤－瘤融合细胞)两种类型。出现不同类型是因为细胞融合不是100%的，且是随机的。3.单克隆抗体的特点是特异性强，灵敏度高，可大量制备。4.第一次筛选的目的是获得杂交瘤细胞①筛选的方法是在培养基中加入氨基嘌呤。②筛选的原理是：B淋巴细胞及同型融合细胞不能增殖、死亡；骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能增殖、死亡；杂交瘤细胞能增殖、生长。③细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。④人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。⑤鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。⑥第二次筛选的目的是获得能产生单一抗体的杂交瘤细胞。五、动物体细胞核移植技术和克隆动物1.原理：概念将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成初期胚胎，继而发育成动物个体的技术。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物原理动物细胞的细胞核具有全能性分类胚胎细胞核移植；体细胞核移植2.体细胞核移植的过程3.克隆高产奶牛的过程①收集牛卵巢，采集卵母细胞②通过显微操作去核③从供体高产奶牛身体的某一部分取体细胞，进行培养④将供体细胞注入去核的卵母细胞⑤通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞形成重构胚⑥将胚胎移入受体(代孕)母牛体内⑦生出与供体奶牛遗传物质相同的犊牛【考点剖析】考点一：动物细胞培养例1．下图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。下列叙述正确的是 ()A．步骤①的操作不需要在无菌环境中进行B．步骤②中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离C．步骤③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理D．步骤④培养过程中不会发生细胞转化【答案】C解析：步骤①和细胞培养过程都需要在无菌环境中进行，A错误；步骤②需要胰蛋白酶处理使细胞分离，盐酸会杀死细胞，B错误；步骤④传代培养过程中，细胞的形态和功能可能会发生变化，从而使细胞发生转化，D错误。考点二：动物细胞培养例2．下列有关动物细胞培养的表述，正确的是()A．培养环境中需要氧气，不需要二氧化碳B．培养的细胞有两类：悬浮生长和贴壁生长，都需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖C．干细胞是从胚胎中分离提取的细胞D．幼龄动物细胞比老龄动物细胞更易于培养【答案】D【解析】动物细胞培养过程既需要O2，也需要CO2，A错误；动物细胞培养中，细胞具有贴壁生长以及接触抑制的特点，因此在培养中需要用胰蛋白酶处理贴壁的细胞并进行分瓶培养，B错误；胚胎干细胞是从早期胚胎或原始性腺中分离提取的细胞，干细胞不一定来自胚胎，如造血干细胞，C错误；幼龄动物组织细胞分裂能力强，因此选择幼龄动物的组织细胞更易于培养，D正确。考点三、动物细胞融合例3．动物细胞融合属于动物细胞工程的技术手段之一，下列有关动物细胞融合的叙述正确的是()A．动物细胞融合产生的细胞称为重组细胞B．融合后形成的细胞为单核或多核细胞C．常用的诱导融合的生物诱导剂是聚乙二醇、灭活的病毒等D．也称细胞杂交，可由两个或多个动物细胞结合成一个细胞【答案】D【解析】动物细胞融合产生的细胞称为杂交细胞，核移植产生的细胞称为重组细胞，A错误；融合后形成具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，B错误；诱导动物细胞融合的生物诱导剂是灭活的病毒，聚乙二醇属于化学诱导剂，C错误；动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，D正确。考点四、单克隆抗体的制备例4.如图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程。下列叙述错误的是()A．反复给小鼠注射甲的目的是让小鼠体内产生更多的抗体B．人工诱导细胞融合获得乙的常用方法是用灭活的病毒C．丁细胞既能无限增殖又能产生抗甲抗原的抗体D．制备的单克隆抗体可以早期诊断人体胃癌的发生情况【答案】A【解析】甲为抗原，反复给小鼠注射甲的目的是对小鼠进行免疫，以便产生更多的能分泌相应抗体的浆细胞，A错误；人工诱导动物细胞融合的常用方法是用灭活的病毒，还可以用聚乙二醇、电激，B正确；丁细胞为筛选出来的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能无限增殖又能产生抗甲抗原的特异性抗体，C正确；单克隆抗体特异性强，灵敏度高，可以在早期检测出人体胃癌的发生情况，D正确。考点五、单克隆抗体的应用例5使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。临床上运用抗体—药物偶联物(ADC)将药物与抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成。下列叙述错误的是()A．ADC中的抗体主要是发挥治疗效应B．ADC中的抗体能特异性识别肿瘤抗原C．ADC中的抗体可以通过杂交瘤技术大量制备D．可以将ADC中的药物换成放射性同位素，标记单克隆抗体进行靶向放疗【答案】A【解析】ADC中抗体的作用是特异性识别肿瘤细胞表面的抗原并与之结合，A错误；抗体能特异性识别抗原并与其结合，题中ADC中的抗体能特异性识别肿瘤抗原，B正确；杂交瘤细胞可以大量制备单克隆抗体，C正确；用放射性同位素标记的单克隆抗体可对肿瘤进行靶向治疗，D正确。考点六、动物体细胞核移植技术和克隆动物例6下列关于体细胞核移植技术应用的叙述，错误的是()A．利用体细胞核移植技术可以加速家畜遗传改良进程B．利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物，可以作为生物反应器生产许多珍贵的医用蛋白C．转基因克隆动物不能作为异种移植的供体进行器官移植，因为会发生免疫排斥反应D．利用体细胞核移植技术培育后代可以避免细胞核供体的线粒体遗传病基因传递给后代【答案】C解析:利用体细胞核移植技术已展示出广阔的应用前景，可以快速繁殖具有优良品质的家畜，可以加速家畜遗传改良进程，A正确；利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产珍贵的医用蛋白，如乳腺生物反应器、膀胱生物反应器等，B正确；设法去除猪抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，可作为异种移植的供体进行器官移植，C错误；利用体细胞核移植技术培育后代由于细胞质来自卵细胞的供体，可以避免细胞核供体的线粒体遗传病基因传递给后代，D正确。【真题演练】1．(2022·江苏高考，14)航天员叶光富和王亚平在天宫课堂上展示了培养的心肌细胞跳动的视频。下列相关叙述正确的是（）A.培养心肌细胞的器具和试剂都要先进行高压蒸汽灭菌B.培养心肌细胞的时候既需要氧气也需要二氧化碳C.心肌细胞在培养容器中通过有丝分裂不断增殖D.心肌细胞在神经细胞发出的神经冲动的支配下跳动2．(2022·湖北高考，7)某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现其培养的原代神经元生长缓慢，其原因不可能的是（）A.实验材料取自小鼠胚胎的脑组织 B.为了防止污染将培养瓶瓶口密封C.血清经过高温处理后加入培养基 D.所使用的培养基呈弱酸性3．(2022·山东高考，15)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是（）A.双抗可同时与2种抗原结合B.利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞C.筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原D.同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞4．(2022·江苏高考，19)（多选）下图表示利用细胞融合技术进行基因定位的过程，在人-鼠杂种细胞中人的染色体会以随机方式丢失，通过分析基因产物进行基因定位。现检测细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中人的4种酶活性，只有Ⅱ具有芳烃羟化酶活性，只有Ⅲ具有胸苷激酶活性，Ⅰ、Ⅲ都有磷酸甘油酸激酶活性，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有乳酸脱氢酶活性。下列相关叙述正确的有（）A.加入灭活仙台病毒的作用是促进细胞融合B.细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为人-人、人-鼠、鼠-鼠融合细胞C.芳烃羟化酶基因位于2号染色体上，乳酸脱氢酶基因位于11号染色上D.胸苷激酶基因位于17号染色体上，磷酸甘油酸激酶基因位于X染色体上5．(2022·海南高考，20)以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4个基因Oct4／Sox2／Nanog／Lin28A的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。（1）CEFs是从孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用___________________________处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加______________等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。（2）体外获取OSNL的方法有______________（答出1种即可）。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和______________等。启动子是______________识别和结合的部位，有了它才能驱动____________________________。（3）iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是______________。（4）诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是__________。（5）该实验流程中用到的生物技术有________________（答出2点即可）。6．(2022·辽宁高考，24)某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制备，流程如图1（1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是___________。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体___________（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。（2）质粒在包装细胞内组装出由___________组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。Ⅱ．N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2（3）用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用___________酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的___________中培养，离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行___________培养。用___________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集___________，提取单克隆抗体。（5）利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成___________，实现特异性治疗。【过关检测】1．植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不相符的是（

）A．纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性B．植物细胞培养和动物细胞培养——细胞的全能性C．原生质体融合和动物细胞融合——生物膜的流动性D．紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂2．中国科学院动物研究所将大熊猫的体细胞核放入兔子的去核卵母细胞之中，并使其成功发育成囊胚，标志着异种核质相容的问题得到解决，异种克隆大熊猫迈过了第一道“坎”；然后至关重要的是选择一种合适的”代孕母体”。下图是该研究的理论流程图。下列说法正确的是（）A．步骤甲、乙分别是指大熊猫体细胞核移植、胚胎收集B．诱导超数排卵所注射的激素只能作用于特定细胞C．重组细胞发育成早期胚胎所需营养主要来源于营养液D．步骤甲和步骤乙中的供体和受体需要同期发情处理3．下列关于动物细胞培养的叙述不正确的是A．动物细胞培养技术的原理是细胞的全能性B．传代培养时需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞C．癌细胞在培养瓶中不会出现接触抑制现象D．动物细胞培养一般需要使用CO2培养箱4．体细胞核移植技术在畜牧业，医药卫生以及其他领域有着广泛的应用前景。下列关于体细胞核移植技术的应用前景及存在问题的叙述，错误的是（

）A．利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产珍贵的医用蛋白B．以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞诱导形成的组织、器官等，可避免免疫排斥反应C．体细胞核移植技术发展到今天，已经相当成熟，成功率较高D．有研究者指出，绝大多数克隆动物存在健康问题，如体型过大、脏器缺陷，免疫失调等5．下列有关细胞工程的叙述，正确的是（

）A．PEG是促细胞融合剂，可直接诱导植物细胞融合B．作物脱毒依据的原理是植物顶端成熟区附近几乎无病毒C．骨髓瘤细胞经免疫处理，可直接获得单克隆抗体D．核移植克隆的动物，其线粒体DNA来自供卵母体6．下列关于动物细胞工程的叙述，正确的是（）A．PEG诱导动物细胞融合形成的杂种细胞，经动物细胞培养能得到优良动物个体B．使用冷冻保存的正常细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型C．在高倍显微镜下观察发生基因突变的细胞比例可推知某化学药品的毒性D．用胰蛋白酶处理动物组织后，可用无菌水稀释制成细胞悬浮液7．某同学在学习“细胞工程”时，列表比较了动植物细胞工程的有关内容，你认为有几处错误(

)植物细胞工程动物细胞工程技术手段植物组织培养

植物体细胞杂交动物细胞培养和融合特殊处理酶解法去除细胞壁胰蛋白酶处理制备细胞悬浮液融合方法物理方法

化学方法物理方法

化学方法

生物方法典型应用人工种子

微型繁殖单克隆抗体的制备等培养液区别植物激素诱导脱分化和再分化动物血清或血浆A．0处 B．1处 C．2处 D．3处8．为了解决杂交瘤细胞在传代培养中出现来自B细胞染色体丢失的问题，研究者在单克隆抗体的制备过程中增加了一个步骤，如下图所示。除了抗原刺激之外，用EBV（一种病毒颗粒）感染动物B细胞，使其染色体核型更稳定。这样的细胞能够在HAT培养基中存活，但对乌本苷（Oua）敏感。下列相关分析错误的是（

）A．杂交瘤细胞具有持续产生抗EBV抗体的能力B．杂交瘤细胞染色体丢失可能导致抗体产生能力下降C．图中B细胞取自于抗原刺激后动物的脾脏等D．骨髓瘤细胞应该无法在HAT选择培养基中存活9．2019年1月24日，我国科学家宣布世界首批疾病克隆猴——5只生物节律紊乱体细胞克隆猴在中国诞生，开启了克隆猴模型应用于生命科学研究的“春天”。科学家采集了一只一岁半的、睡眠紊乱最明显的BMAL1（生物节律基因）敲除猴A6的体细胞，通过体细胞核移植技术，获得了5只克隆猴——这是国际上首次成功构建一批遗传背景一致的生物节律紊乱猕猴模型。下列相关叙述错误的是（

）A．体细胞核移植技术的原理是动物细胞（核）的全能性B．5只克隆猕猴细胞核基因型与核供体细胞完全一致C．体细胞核移植需用取自新鲜卵巢的卵母细胞直接做受体细胞D．该研究可弥补实验猕猴繁殖周期长、单胎数量少的不足10．牛雄性胚胎中存在特异性H-Y抗原，可在牛早期胚胎培养液中添加H-Y单克隆抗体，筛选胚胎进行移植，以利用乳腺生物反应器进行生物制药。下列相关叙述正确的是（

）A．H-Y单克隆抗体由骨髓瘤细胞分泌 B．应选用原肠胚做雌雄鉴别C．鉴别后的雄性胚胎可直接做胚胎移植 D．用H-Y抗原刺激母牛可获得相应抗体11．下列关于生物工程的叙述，错误的是（

）A．可利用植物组织培养技术实现紫草素的工厂化生产B．由根尖细胞形成愈伤组织的过程中，可能会发生基因突变C．动物细胞融合与植物体细胞杂交所依据的原理相同，都能形成杂种个体D．试管动物技术可以充分发挥优良动物的繁殖潜力12．“筛选”是生物中常用的技术手段，下列相关叙述中正确的是（

）A．制备单克隆抗体过程中，第一次从细胞水平筛选出杂交瘤细胞，第二次从分子水平筛选出产生所需抗体的杂交瘤细胞B．单倍体育种中需对F1的花药进行筛选C．为了快速繁殖无子西瓜，需筛选出特定的体细胞才能进行组织培养D．通过显微镜观察染色体数目诊断先天愚型是分子水平的检测13．下图是科研人员将药物与单克隆抗体连接形成的抗体—药物偶联物(ADC)的示意图，它由抗体、接头和药物三部分组成，能实现对肿瘤细胞的选择性杀伤。相关叙述正确的是（

）A．细胞膜的选择透过性是抗体制备过程中细胞融合的基础B．ADC能识别肿瘤细胞利用了药物特异性杀伤靶细胞的原理C．肿瘤细胞被ADC选择性杀伤而导致的死亡属于细胞坏死D．用放射性同位素标记的单克隆抗体可对肿瘤进行靶向治疗14．下面是单克隆抗体制备过程示意图，1～6代表相关过程，a～e代表相关细胞，以下叙述错误的是（

）

A．过程1是给小鼠注射特定抗原蛋白，以刺激小鼠产生相应抗体的B淋巴细胞B．c细胞有三种种类，每种细胞染色体组数是相等的，e细胞是杂交瘤细胞C．过程2的促融方法可以采用电融合技术，这种技术能击穿核膜促使核融合D．过程3是抗体检测及克隆产生阳性细胞的过程，此过程要进行两次15．细胞融合技术有着广泛应用，如图为细胞融合的简略过程。据图分析，下列叙述不正确的是（

）A．甲形成过程中，a和b需要通过细胞膜接触完成识别和结合B．乙形成过程中培养液渗透压略大于细胞质，有助于植物细胞酶解法去壁C．若a和b分别为基因型AaBB、aaBb植株的花粉细胞，则去壁后两两融合可得到4种基因型细胞D．借助单克隆抗体的导向作用能将药物定向带到癌细胞所在位置16．下图为细胞融合的简略过程。下列相关叙述中正确的是（

）A．如果a和b分别是白菜和甘蓝的体细胞，则需要用纤维素酶和果胶酶处理这两种细胞B．如果d经分裂分化形成的是有性杂交后代，则a和b融合形成c的过程是受精作用C．如果培养d可得到单克隆抗体，则细胞d既能无限增殖也能产生抗体D．将d培养成体细胞杂交植株的过程可以说明植物细胞具有全能性17．T细胞表面的受体可以识别抗原引起免疫反应，同时还有很多辅助分子来帮助完成这一过程。此外，T细胞表面还存在负向调控的受体分子，如PD-1。当PD-1与某些特定分子治PDL1结合后，能迫使免疫细胞自杀，从而终止正在进行的免疫反应。：一些肿瘤细胞进化出了一种防御机制，它们的表面也带有PDL1，从而诱导T细胞过早地进入自我破坏程序。科学家研制出PD-1单克隆抗体，作为免疫负调控抑制剂，通过阻断PD-1与PDL1的相互作用，从而降低免疫抑制反应，进而治疗甚至治愈肿瘤。下列叙述正确的是（

）A．正常情况下，PD-1有助于防止免疫反应过度，避免发生自身免疫病B．部分T细胞会在PD-1的作用下发生细胞凋亡C．PD-1单克隆抗体不是直接作用于肿瘤，而是对免疫细胞起作用，达到抗肿瘤的目的D．体细胞中同时含有控制合成PD-1的基因和控制合成PDL1的基因18．下图是一种“生物导弹”的作用原理示意图，没有与肿瘤细胞结合的“生物导弹”一段时间后被机体清除。阿霉素是一种抗肿瘤药，可抑制DNA和RNA的合成，对正常细胞也有一定毒性。下列相关说法正确的是（

）A．单克隆抗体是由杂交瘤细胞合成和分泌的B．活化阿霉素能抑制细胞中的DNA复制和转录过程C．在治疗中，应先注射非活化的磷酸酶，再注射生物导弹D．单克隆抗体特异性强，能减轻阿霉素对正常细胞的伤害19．亨廷顿舞蹈症（HD）患者是由于编码亨廷顿蛋白的基因（H基因）序列中的三个核苷酸（CAG）发生多次重复所致。（1）某HD家系图（图1）及每个个体CAG重复序列扩增后，电泳结果如图2。①据图1判断HD是一种__________染色体遗传病。②据图推测，当个体的所有H基因中CAG重复次数__________25次时才可能不患病。与Ⅰ-1比较，Ⅱ-1并未患病，推测该病会伴随__________呈渐进性发病。③与Ⅰ-1比较，Ⅱ-1、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5的H基因中CAG重复次数均有增加，这表明患者Ⅰ-1__________过程中异常H基因的重复次数会增加。（2）由于缺乏合适的动物模型用于药物筛选，HD患者目前尚无有效的治疗方法。我国科学家利用基因编辑技术和体细胞核移植技术成功培育出世界首例含人类突变H基因的模型猪，操作过程如图3。①从可遗传变异类型来看，模型猪发生的变异是__________。②筛选含有目的基因的体细胞，将细胞核移植到__________中，构建重组细胞，再将重组细胞发育来的早期胚胎移植到代孕母猪体内，获得子代F0，此过程体现出动物细胞核具有__________。③将F0与野生型杂交得到F1，F1再与野生型杂交得到F2。在F0、F1、F2中，更适合作为模型猪的是F2个体，理由是__________。20．埃博拉病毒（EBO）呈纤维状，EBO衣壳外有包膜，包膜上有5种蛋白棘突（VP系列蛋白和GP蛋白），其中GP蛋白最为关键，能被宿主细胞强烈识别。人感染埃博拉病毒后会引起出血热，治疗该病的有效方法是注射疫苗或者抗体。下图为制备埃博拉病毒的单克隆抗体的过程，据图回答问题：(1)埃博拉病毒侵入人体时，在细胞中以RNA为模板，在__________酶的作用下，合成相应的DNA并指导蛋白质合成，进行增殖。以GP蛋白作为疫苗比较安全，其原因是GP蛋白自身没有感染能力，但保留有______________________。(2)已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合的过程体现了细胞膜具有_______的结构特点。在体外融合时需要诱导，与诱导植物原生质体融合不同的是图中还可用__________诱导融合。筛选后的所需细胞群应具备的特点是______________________。(3)在体外进行动物细胞培养时需要在合成培养基的基础上添加___________等天然成分。同时为了维持培养液的pH，需要提供的气体环境是____________。(4)获得的单克隆抗体最终可以从____________中提取。“抗体—药物偶联物”中，抗体的靶向作用是利用了其具有____________________的特点。21．自2019年12月起，由新型冠状病毒SARS-CoV-2引发的新冠肺炎成为全球公共卫生的重大威胁。某些患者早期病情较轻，后期因发生细胞因子风暴病情突然加重。细胞因子是具有免疫调节功能的小分子蛋白质，细胞因子风暴是机体免疫系统被过度激活的一种状态，其造成肺损伤的机制如下图所示。（1）免疫细胞包含多种类型，图中未提到的一类是_______。（2）据图可知，利用________的受体免疫实验动物后，制备的单克隆抗体可用于新冠肺炎细胞因子风暴的治疗。（3）我国医疗工作者用脐带间充质干细胞静脉输入法对4例新冠肺炎重症患者进行了治疗，效果良好。干细胞的特点是________，脐带间充质干细胞除有干细胞特点外，还可以分泌多种营养因子和调节物质，其表面抗原不明显，不会引起患者免疫排斥。由此分析，在治疗过程中间充质干细胞发挥的作用可能是________。（4）在“疫情防控常态化”阶段，新冠疫苗研制更加重要，我国科学工作者研发的重组腺病毒疫苗已进入临床实验阶段。①腺病毒疫苗中腺病毒是作为________。②腺病毒对于增殖和非增殖细胞均具有感染能力，且不整合进入宿主细胞的染色体基因组，与其他重组逆转录病毒疫苗相比可减少多种临床风险，________请列出其中1点。③新冠疫苗可能存在的局限性是________（写出1点即可）第05讲动物细胞工程【考点剖析】考点一：动物细胞培养例1．下图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。下列叙述正确的是 ()A．步骤①的操作不需要在无菌环境中进行B．步骤②中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离C．步骤③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理D．步骤④培养过程中不会发生细胞转化【答案】C解析：步骤①和细胞培养过程都需要在无菌环境中进行，A错误；步骤②需要胰蛋白酶处理使细胞分离，盐酸会杀死细胞，B错误；步骤④传代培养过程中，细胞的形态和功能可能会发生变化，从而使细胞发生转化，D错误。考点二：动物细胞培养例2．下列有关动物细胞培养的表述，正确的是()A．培养环境中需要氧气，不需要二氧化碳B．培养的细胞有两类：悬浮生长和贴壁生长，都需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖C．干细胞是从胚胎中分离提取的细胞D．幼龄动物细胞比老龄动物细胞更易于培养【答案】D【解析】动物细胞培养过程既需要O2，也需要CO2，A错误；动物细胞培养中，细胞具有贴壁生长以及接触抑制的特点，因此在培养中需要用胰蛋白酶处理贴壁的细胞并进行分瓶培养，B错误；胚胎干细胞是从早期胚胎或原始性腺中分离提取的细胞，干细胞不一定来自胚胎，如造血干细胞，C错误；幼龄动物组织细胞分裂能力强，因此选择幼龄动物的组织细胞更易于培养，D正确。考点三、动物细胞融合例3．动物细胞融合属于动物细胞工程的技术手段之一，下列有关动物细胞融合的叙述正确的是()A．动物细胞融合产生的细胞称为重组细胞B．融合后形成的细胞为单核或多核细胞C．常用的诱导融合的生物诱导剂是聚乙二醇、灭活的病毒等D．也称细胞杂交，可由两个或多个动物细胞结合成一个细胞【答案】D【解析】动物细胞融合产生的细胞称为杂交细胞，核移植产生的细胞称为重组细胞，A错误；融合后形成具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，B错误；诱导动物细胞融合的生物诱导剂是灭活的病毒，聚乙二醇属于化学诱导剂，C错误；动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，D正确。考点四、单克隆抗体的制备例4.如图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程。下列叙述错误的是()A．反复给小鼠注射甲的目的是让小鼠体内产生更多的抗体B．人工诱导细胞融合获得乙的常用方法是用灭活的病毒C．丁细胞既能无限增殖又能产生抗甲抗原的抗体D．制备的单克隆抗体可以早期诊断人体胃癌的发生情况【答案】A【解析】甲为抗原，反复给小鼠注射甲的目的是对小鼠进行免疫，以便产生更多的能分泌相应抗体的浆细胞，A错误；人工诱导动物细胞融合的常用方法是用灭活的病毒，还可以用聚乙二醇、电激，B正确；丁细胞为筛选出来的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能无限增殖又能产生抗甲抗原的特异性抗体，C正确；单克隆抗体特异性强，灵敏度高，可以在早期检测出人体胃癌的发生情况，D正确。考点五、单克隆抗体的应用例5使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。临床上运用抗体—药物偶联物(ADC)将药物与抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成。下列叙述错误的是()A．ADC中的抗体主要是发挥治疗效应B．ADC中的抗体能特异性识别肿瘤抗原C．ADC中的抗体可以通过杂交瘤技术大量制备D．可以将ADC中的药物换成放射性同位素，标记单克隆抗体进行靶向放疗【答案】A【解析】ADC中抗体的作用是特异性识别肿瘤细胞表面的抗原并与之结合，A错误；抗体能特异性识别抗原并与其结合，题中ADC中的抗体能特异性识别肿瘤抗原，B正确；杂交瘤细胞可以大量制备单克隆抗体，C正确；用放射性同位素标记的单克隆抗体可对肿瘤进行靶向治疗，D正确。考点六、动物体细胞核移植技术和克隆动物例6下列关于体细胞核移植技术应用的叙述，错误的是()A．利用体细胞核移植技术可以加速家畜遗传改良进程B．利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物，可以作为生物反应器生产许多珍贵的医用蛋白C．转基因克隆动物不能作为异种移植的供体进行器官移植，因为会发生免疫排斥反应D．利用体细胞核移植技术培育后代可以避免细胞核供体的线粒体遗传病基因传递给后代【答案】C解析:利用体细胞核移植技术已展示出广阔的应用前景，可以快速繁殖具有优良品质的家畜，可以加速家畜遗传改良进程，A正确；利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产珍贵的医用蛋白，如乳腺生物反应器、膀胱生物反应器等，B正确；设法去除猪抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，可作为异种移植的供体进行器官移植，C错误；利用体细胞核移植技术培育后代由于细胞质来自卵细胞的供体，可以避免细胞核供体的线粒体遗传病基因传递给后代，D正确。【真题演练】1．(2022·江苏高考，14)航天员叶光富和王亚平在天宫课堂上展示了培养的心肌细胞跳动的视频。下列相关叙述正确的是（）A.培养心肌细胞的器具和试剂都要先进行高压蒸汽灭菌B.培养心肌细胞的时候既需要氧气也需要二氧化碳C.心肌细胞在培养容器中通过有丝分裂不断增殖D.心肌细胞在神经细胞发出的神经冲动的支配下跳动【答案】B【解析】动物细胞培养的过程：取动物组织块→剪碎组织→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中（原代培养）→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞，制成细胞悬液→转入培养液（传代培养）→放入二氧化碳培养箱培养。培养心肌细胞的器具要先进行高压蒸汽灭菌，但是试剂并不都需要灭菌，如动物血清不能进行高压蒸汽灭菌，否则会使其中的成分失活，A错误；培养心肌细胞的时候既需要氧气（有助于进行有氧呼吸）也需要二氧化碳（有助于维持培养液的pH），B正确；心肌细胞高度分化，不能进行有丝分裂，C错误；心肌细胞节律性收缩，受植物性神经的支配，是不2222随意的，在神经细胞释放的神经递质的支配下跳动，D错误。2．(2022·湖北高考，7)某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现其培养的原代神经元生长缓慢，其原因不可能的是（）A.实验材料取自小鼠胚胎的脑组织 B.为了防止污染将培养瓶瓶口密封C.血清经过高温处理后加入培养基 D.所使用的培养基呈弱酸性【答案】A【解析】小鼠原代神经元培养属于动物细胞培养，需要在无菌无毒和培养液提供类似内环境的条件下进行。小鼠胚胎脑组织中含有丰富的原代神经元，细胞增殖能力强，不会造成生长缓慢，A符合题意；培养瓶瓶口密封会使培养液中缺氧，影响细胞有氧呼吸，造成供能不足，可能使细胞生长缓慢，B不符合题意；血清经过高温处理后，其中活性成分变性，失去原有功能，细胞生存环境严重恶化，可能使细胞生长缓慢，C不符合题意；小鼠内环境为弱碱性，所使用的培养基呈弱酸性，使细胞生存环境恶劣，可能造成细胞生长缓慢，D不符合题意。3．(2022·山东高考，15)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是（）A.双抗可同时与2种抗原结合B.利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞C.筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原D.同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞【答案】D【解析】单克隆抗体的制备过程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。根据抗原和抗体发生特异性结合的原理推测，双抗可同时与2种抗原结合，A正确；根据抗原与抗体能够发生特异性结合的特性，利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞，从而使药物发挥相应的作用，B正确；由于双抗是在两种不同的抗原刺激下，B细胞增殖、分化产生不同的浆细胞分泌形成的，因此，筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原来进行抗原-抗体检测，从而实现对双抗的筛选，C正确；同时注射2种抗原可刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，而不是分化成产双抗的浆细胞，D错误。4．(2022·江苏高考，19)（多选）下图表示利用细胞融合技术进行基因定位的过程，在人-鼠杂种细胞中人的染色体会以随机方式丢失，通过分析基因产物进行基因定位。现检测细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中人的4种酶活性，只有Ⅱ具有芳烃羟化酶活性，只有Ⅲ具有胸苷激酶活性，Ⅰ、Ⅲ都有磷酸甘油酸激酶活性，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有乳酸脱氢酶活性。下列相关叙述正确的有（）A.加入灭活仙台病毒的作用是促进细胞融合B.细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为人-人、人-鼠、鼠-鼠融合细胞C.芳烃羟化酶基因位于2号染色体上，乳酸脱氢酶基因位于11号染色上D.胸苷激酶基因位于17号染色体上，磷酸甘油酸激酶基因位于X染色体上【答案】ACD【解析】分析题干信息：Ⅰ保留X、11号染色体，Ⅱ保留2、11号染色体，具有芳烃羟化酶活性，Ⅲ，保留X、11、17号染色体具有胸苷激酶活性，Ⅰ、Ⅲ都有磷酸甘油酸激酶活性，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有乳酸脱氢酶活性，所以支配芳烃羟化酶合成的基因位于2号染色体上，支配胸苷激酶合成的基因位于17号染色体上；支配磷酸甘油酸激合成的基因位于X号染色体上；支配乳酸脱氢酶合成的基因位于11号染色体上。动物细胞融合过程中，可以利用灭活的仙台病毒或聚乙二醇作诱导剂促进细胞融合，A正确；细胞Ⅲ中保留了人的X、11、17号染色体，故不会是鼠-鼠融合细胞，B错误；根据分析可知，芳烃羟化酶基因位于2号染色体上，乳酸脱氢酶基因位于11号染色上，胸苷激酶基因位于17号染色体上，磷酸甘油酸激酶基因位于X染色体上，CD正确。5．(2022·海南高考，20)以我国科学家为主的科研团队将OSNL（即4个基因Oct4／Sox2／Nanog／Lin28A的缩写）导入黑羽鸡胚成纤维细胞（CEFs），诱导其重编程为诱导多能干细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs），然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。（1）CEFs是从孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用___________________________处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加______________等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。（2）体外获取OSNL的方法有______________（答出1种即可）。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和______________等。启动子是______________识别和结合的部位，有了它才能驱动____________________________。（3）iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是______________。（4）诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是__________。（5）该实验流程中用到的生物技术有________________（答出2点即可）。【答案】（1）①.胰蛋白酶、胶原蛋白酶等②.动物血清（2）①.PCR技术、人工合成法②.终止子③.RNA聚合酶④.目的基因转录出mRNA，最终表达出所需要的蛋白质（3）基因的选择性表达（4）诱导iPS细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术（5）基因工程、动物细胞培养【解析】胚胎干细胞（ES细胞）具有自我更新及多向分化潜能，为发育学、遗传学、人类疾病的发病机理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。iPS细胞技术是借助基因导入技术将某些特定因子基因导入动物或人的体细胞，以将其重编程或诱导为ES细胞样的细胞，即iPS细胞。（1）动物细胞培养时，鸡胚组织剪碎后需用胰蛋白酶处理，以获得单细胞悬液。动物细胞培养时一般需要在合成培养基中添加血清等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。（2）OSNL为目的基因，体外获取目的基因可通过PCR技术大量扩增或通过人工合成法来合成。基因表达载体中除目的基因外，还必须有启动子、终止子、复制原点和标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。（3）据图可知，由iPS细胞诱导形成iPGCs细胞经过了细胞分化，该过程遗传物质没有改变，导致其细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是基因的选择性表达。（4）诱导iPS细胞的技术是将已经分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞（iPS），再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞（iPGCs）的技术，而细胞核移植技术是将动物的一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞内，使这个重组的细胞发育为胚胎，继而发育为动物个体的技术。（5）由图可知，该实验流程中将OSNL基因导入鸡胚成纤维细胞利用了基因工程技术，诱导多能干细胞过程利用了动物细胞培养的技术。6．(2022·辽宁高考，24)某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。Ⅰ．N蛋白胞外段抗原制备，流程如图1（1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是___________。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体___________（填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。（2）质粒在包装细胞内组装出由___________组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。Ⅱ．N蛋白胞外段单克隆抗体制备，流程如图2（3）用N蛋白胞外段作为抗原对小鼠进行免疫后，取小鼠脾组织用___________酶处理，制成细胞悬液，置于含有混合气体的___________中培养，离心收集小鼠的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞进行融合。（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行___________培养。用___________技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集___________，提取单克隆抗体。（5）利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成___________，实现特异性治疗。【答案】（1）①.检测目的基因是否成功导入受体细胞②.双分子层中（2）蛋白质外壳和含N蛋白胞外段基因的核酸（3）①.胰蛋白酶或胶原蛋白②.CO2培养箱（4）①.克隆化②.抗原抗体杂交③.细胞培养液（5）抗体-药物偶联物##ADC【解析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。两次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞（去掉未杂交的细胞以及自身融合的细胞）；②筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。（1）构建重组慢病毒质粒时，为检测目的基因是否成功导入受体细胞，常选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因。重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞需要依赖膜融合，故质粒被包在脂质体双分子层中（即磷脂双分子层）。（2）由于目的基因为N蛋白胞外段基因，在包装细胞内组装出由蛋白质外壳和含有N蛋白胞外段基因的核酸组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。（3）进行动物细胞培养时，需要取小鼠脾组织用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，制成细胞悬液，置于含有95%空气和5%的CO2混合气体的CO2培养箱中培养。（4）用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行克隆化培养和抗体检测。用抗原抗体杂交技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养，收集细胞培养液，提取单克隆抗体。（5）利用N蛋白胞外段抗体与药物结合，形成抗体-药物偶联物ADC，实现特异性治疗。【过关检测】1．植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不相符的是（

）A．纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性B．植物细胞培养和动物细胞培养——细胞的全能性C．原生质体融合和动物细胞融合——生物膜的流动性D．紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂【答案】B【解析】用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁获得原生质体和用胰蛋白酶处理动物组织得到单个细胞都采用了酶的专一性原理。诱导原生质体融合和动物细胞融合都采用了生物膜的流动性原理。植物组织培养的原理是细胞的全能性。动物细胞培养的原理是细胞增殖。细胞工程中，利用酶的专一性原理，用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁获得原生质体，用胰蛋白酶处理动物组织得到单个细胞，A正确；植物组织培养的原理是细胞的全能性，而动物细胞培养的原理是细胞增殖，B错误；利用生物膜的流动性原理，采用诱导技术可以诱导原生质体融合和动物细胞融合，C正确；紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养的原理都是细胞增殖（分裂），D正确。2．中国科学院动物研究所将大熊猫的体细胞核放入兔子的去核卵母细胞之中，并使其成功发育成囊胚，标志着异种核质相容的问题得到解决，异种克隆大熊猫迈过了第一道“坎”；然后至关重要的是选择一种合适的”代孕母体”。下图是该研究的理论流程图。下列说法正确的是（）A．步骤甲、乙分别是指大熊猫体细胞核移植、胚胎收集B．诱导超数排卵所注射的激素只能作用于特定细胞C．重组细胞发育成早期胚胎所需营养主要来源于营养液D．步骤甲和步骤乙中的供体和受体需要同期发情处理【答案】B【解析】步骤甲、乙分别指的是核质融合、胚胎移植，A错误；诱导超数排卵所注射的激素是促性腺激素，只能作用于性腺，B正确；重组细胞发育成早期胚胎所需营养主要来源于卵细胞，C错误；步骤甲是细胞核移植，供体是提供细胞核的个体，其供体和受体不需要同期发情处理，D错误。3．下列关于动物细胞培养的叙述不正确的是A．动物细胞培养技术的原理是细胞的全能性B．传代培养时需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞C．癌细胞在培养瓶中不会出现接触抑制现象D．动物细胞培养一般需要使用CO2培养箱【答案】A【解析】动物细胞培养技术的原理是细胞增殖，A错误；传代培养时需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞，使其分散培养，B正确；癌细胞在培养瓶中不会出现接触抑制现象，能无限增殖，C正确；动物细胞培养一般需要使用CO2培养箱，以维持培养液pH值，D正确。4．体细胞核移植技术在畜牧业，医药卫生以及其他领域有着广泛的应用前景。下列关于体细胞核移植技术的应用前景及存在问题的叙述，错误的是（

）A．利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产珍贵的医用蛋白B．以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞诱导形成的组织、器官等，可避免免疫排斥反应C．体细胞核移植技术发展到今天，已经相当成熟，成功率较高D．有研究者指出，绝大多数克隆动物存在健康问题，如体型过大、脏器缺陷，免疫失调等【答案】C【解析】利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产珍贵的医用蛋白，A正确；以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞诱导形成的组织、器官等，可避免免疫排斥反应，B正确；尽管通过体细胞核移植技术已经获得了多种克隆动物，但该技术的成功率仍然非常低，各个技术环节也有待进一步改进，C错误；有研究者指出，绝大多数克隆动物存在健康问题，如体型过大、脏器缺陷，免疫失调等，D正确。5．下列有关细胞工程的叙述，正确的是（

）A．PEG是促细胞融合剂，可直接诱导植物细胞融合B．作物脱毒依据的原理是植物顶端成熟区附近几乎无病毒C．骨髓瘤细胞经免疫处理，可直接获得单克隆抗体D．核移植克隆的动物，其线粒体DNA来自供卵母体【答案】D【解析】诱导植物细胞融合前需要先去除细胞壁获得原生质体，然后才能能用PEG等方法诱导原生质体融合，A错误；作物脱毒依据的原理是植物顶端分生区附近几乎无病毒，B错误；骨髓瘤细胞经免疫处理也不能产生抗体，需要筛选出杂交瘤细胞才能获得单克隆抗体，C错误；核移植克隆的动物，其线粒体DNA来自供细胞质的供体，即供卵母体，D正确。6．下列关于动物细胞工程的叙述，正确的是（）A．PEG诱导动物细胞融合形成的杂种细胞，经动物细胞培养能得到优良动物个体B．使用冷冻保存的正常细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型C．在高倍显微镜下观察发生基因突变的细胞比例可推知某化学药品的毒性D．用胰蛋白酶处理动物组织后，可用无菌水稀释制成细胞悬浮液【答案】B【解析】本题主要动物细胞的组织培养及细胞融合。细胞全能性是指已经分化的细胞，仍然具有发育成个体的潜能。动物细胞的培育过程是用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理组织细胞一段时间，使组织分散成单个细胞，再用培养液将分散的细胞稀释制成细胞悬液进行培养，由于动物细胞结构和功能复杂，目前仅证实动物细胞核具有全能性，动物体细胞的全能性还有待技术发展。目前为止，人们还没有成功将单个分化的动物体细胞培养成个体，动物细胞的全能性受到限制，动物细胞融合形成的杂种细胞不能培育成动物，A错误；目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型，B正确；基因突变是碱基对增添、缺失或替换，碱基对的改变在光学显微镜下无法观察到，C错误；用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理动物组织会使组织就会分散成单个细胞，再用培养液将分散的细胞稀释制成细胞悬液，而不是无菌水，D错误。7．某同学在学习“细胞工程”时，列表比较了动植物细胞工程的有关内容，你认为有几处错误(

)植物细胞工程动物细胞工程技术手段植物组织培养

植物体细胞杂交动物细胞培养和融合特殊处理酶解法去除细胞壁胰蛋白酶处理制备细胞悬浮液融合方法物理方法

化学方法物理方法

化学方法

生物方法典型应用人工种子

微型繁殖单克隆抗体的制备等培养液区别植物激素诱导脱分化和再分化动物血清或血浆A．0处 B．1处 C．2处 D．3处【答案】A【解析】细胞工程包括植物细胞过程和动物细胞工程，植物细胞过程包括植物组织培养和植物体细胞杂交技术；动物细胞工程包括动物细胞培养和核移植技术、动物细胞融合和单克隆抗体的制备。技术手段：植物细胞过程包括植物组织培养和植物体细胞杂交；动物细胞工程包括动物细胞培养、动物细胞融合等，正确；植物体细胞杂交时，采用酶解法（纤维素酶和果胶酶）去除细胞壁；动物细胞培养时，需要采用胰蛋白酶处理，制成细胞悬液，正确；诱导植物细胞融合的方法有物理（离心、振动和电激等）和化学方法（聚乙二醇）；诱导动物细胞融合的方法有物理、化学和生物方法（灭活的病毒），正确；植物细胞工程技术可应用于制备人工种子、微型繁殖等；动物细胞工程中的动物细胞融合技术可以用于制备单克隆抗体，正确；植物细胞工程中的培养基中需要用生长素和细胞分裂素以影响愈伤组织的生长和分化；动物细胞工程的培养液中需要加入动物血清、血浆等天然成分，正确。因此，以上说法都是正确的。8．为了解决杂交瘤细胞在传代培养中出现来自B细胞染色体丢失的问题，研究者在单克隆抗体的制备过程中增加了一个步骤，如下图所示。除了抗原刺激之外，用EBV（一种病毒颗粒）感染动物B细胞，使其染色体核型更稳定。这样的细胞能够在HAT培养基中存活，但对乌本苷（Oua）敏感。下列相关分析错误的是（

）A．杂交瘤细胞具有持续产生抗EBV抗体的能力B．杂交瘤细胞染色体丢失可能导致抗体产生能力下降C．图中B细胞取自于抗原刺激后动物的脾脏等D．骨髓瘤细胞应该无法在HAT选择培养基中存活【答案】A【解析】题图分析：图示为单克隆抗体制备过程，除了抗原刺激之外，还用EBV（一种病毒颗粒）感染动物B淋巴细胞，使其染色体核型更稳定，不易发生变异，该细胞株能够在HAT培养基中存活。本实验中EBV的作用是使B细胞染色体核型更稳定，而不是刺激B细胞分化成浆细胞产生抗体，所以该杂交瘤细胞不能产生抗EBV的抗体，A错误；杂交瘤细胞染色体丢失可能导致细胞发生变异，从而导致抗体产生能力下降，B正确；B细胞分布在脾脏和淋巴结等免疫器官中，所以在单克隆抗体制备过程中，B细胞取自于抗原刺激后动物的淋巴结或脾脏等，C正确；据图可知，骨髓瘤细胞在HAT选择培养基中死亡，D正确。9．2019年1月24日，我国科学家宣布世界首批疾病克隆猴——5只生物节律紊乱体细胞克隆猴在中国诞生，开启了克隆猴模型应用于生命科学研究的“春天”。科学家采集了一只一岁半的、睡眠紊乱最明显的BMAL1（生物节律基因）敲除猴A6的体细胞，通过体细胞核移植技术，获得了5只克隆猴——这是国际上首次成功构建一批遗传背景一致的生物节律紊乱猕猴模型。下列相关叙述错误的是（

）A．体细胞核移植技术的原理是动物细胞（核）的全能性B．5只克隆猕猴细胞核基因型与核供体细胞完全一致C．体细胞核移植需用取自新鲜卵巢的卵母细胞直接做受体细胞D．该研究可弥补实验猕猴繁殖周期长、单胎数量少的不足【答案】C【解析】动物体细胞核移植：将动物的一个细胞的细胞核移入一个去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为克隆动物。克隆动物具备双亲的遗传特性，因为其细胞核基因来自提供细胞核的生物，而细胞质基因来自提供细胞质的生物，但其性状主要与提供细胞核的生物相似。动物细胞核移植获得克隆动物所依据的原理是动物细胞核具有全能性，A正确；5只克隆猕猴是通过体细胞核移植技术获得的，其细胞核基因型与核供体细胞完全一致，B正确；取自卵巢的卵母细胞需要培养到MⅡ中期时，才可进行核移植，C错误；体细胞核移植时供核的供体可不受年龄影响，且体细胞数量多，所以该研究可弥补实验猕猴繁殖周期长、单胎数量少的不足，D正确。10．牛雄性胚胎中存在特异性H-Y抗原，可在牛早期胚胎培养液中添加H-Y单克隆抗体，筛选胚胎进行移植，以利用乳腺生物反应器进行生物制药。下列相关叙述正确的是（

）A．H-Y单克隆抗体由骨髓瘤细胞分泌 B．应选用原肠胚做雌雄鉴别C．鉴别后的雄性胚胎可直接做胚胎移植 D．用H-Y抗原刺激母牛可获得相应抗体【答案】D【解析】效应B细胞能够分泌抗体，但是不具有增殖能力，而骨髓瘤细胞具有无线增殖的能力，因此利用动物细胞融合技术将效应B细胞和骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，利用该细胞制备单克隆抗体。该杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生特异性抗体，并且单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、可大量制备等特点。单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌的，A错误；做雌雄性别鉴别应选择囊胚期的滋养层细胞，B错误；由于是利用乳腺生物反应器进行生物制药，则鉴别后的雌性胚胎可直接做胚胎移植，雄性胚胎没有意义，C错误；H-Y抗原免疫母牛，使其体内产生体液免疫，产生相应的浆细胞，获得相应抗体，D正确。11．下列关于生物工程的叙述，错误的是（

）A．可利用植物组织培养技术实现紫草素的工厂化生产B．由根尖细胞形成愈伤组织的过程中，可能会发生基因突变C．动物细胞融合与植物体细胞杂交所依据的原理相同，都能形成杂种个体D．试管动物技术可以充分发挥优良动物的繁殖潜力【答案】C【解析】胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术。“试管动物”与“试管婴儿”一样，是将哺乳动物的卵子和精子，在体外条件下完成受精过程，并培养成胚胎，移植入雌性动物生殖道内而获得后代。可利用植物组织培养技术获得愈伤组织，实现紫草素的工厂化生产，A正确；由根尖细胞形成愈伤组织的过程中，可能会发生基因突变，B正确；动物细胞融合与植物体细胞杂交相比，诱导融合的方法、所用的技术手段、所依据的原理均不完全相同，动物细胞融合不能形成杂种个体，而植物细胞融合能形成杂种个体，但两者都能形成杂种细胞，C错误；试管动物技术是进行体外受精，可以充分发挥优良动物的繁殖潜力，D正确。12．“筛选”是生物中常用的技术手段，下列相关叙述中正确的是（

）A．制备单克隆抗体过程中，第一次从细胞水平筛选出杂交瘤细胞，第二次从分子水平筛选出产生所需抗体的杂交瘤细胞B．单倍体育种中需对F1的花药进行筛选C．为了快速繁殖无子西瓜，需筛选出特定的体细胞才能进行组织培养D．通过显微镜观察染色体数目诊断先天愚型是分子水平的检测【答案】A【解析】单克隆抗体制备过程中，第一次从细胞水平筛选出杂交瘤细胞，第二次从分子水平筛选出既能无限增殖又能产生特定抗体的杂交瘤细胞，A正确；单倍体育种中，不需要对F1的花药进行筛选，可直接根据单倍体的性状进行筛选，B错误；三倍体无籽西瓜的体细胞的染色体组数都是3个，不需要筛选，不过需用分化程度低的体细胞进行组织培养，C错误；先天性愚型（21三体综合征）属于染色体数目变异遗传病，通过显微镜观察染色体数目诊断先天愚型是细胞水平的检测，D错误。13．下图是科研人员将药物与单克隆抗体连接形成的抗体—药物偶联物(ADC)的示意图，它由抗体、接头和药物三部分组成，能实现对肿瘤细胞的选择性杀伤。相关叙述正确的是（

）A．细胞膜的选择透过性是抗体制备过程中细胞融合的基础B．ADC能识别肿瘤细胞利用了药物特异性杀伤靶细胞的原理C．肿瘤细胞被ADC选择性杀伤而导致的死亡属于细胞坏死D．用放射性同位素标记的单克隆抗体可对肿瘤进行靶向治疗【答案】D【解析】细胞膜的流动性是抗体制备过程中细胞融合的基础，A错误；据题图分析可知，ADC杀伤特定肿瘤细胞，是通过受体识别肿瘤细胞表面的抗原一抗体复合物来实现的，B错误；肿瘤细胞被ADC选择性杀伤而导致的死亡属于细胞凋亡，C错误；抗体能特异性的识别抗原，癌变的细胞可以看成自身抗原，用放射性同位素标记的单克隆抗体可对肿瘤进行靶向治疗，D正确。14．下面是单克隆抗体制备过程示意图，1～6代表相关过程，a～e代表相关细胞，以下叙述错误的是（

）

A．过程1是给小鼠注射特定抗原蛋白，以刺激小鼠产生相应抗体的B淋巴细胞B．c细胞有三种种类，每种细胞染色体组数是相等的，e细胞是杂交瘤细胞C．过程2的促融方法可以采用电融合技术，这种技术能击穿核膜促使核融合D．过程3是抗体检测及克隆产生阳性细胞的过程，此过程要进行两次【答案】C【解析】过程1是给小鼠注射特定抗原蛋白，以刺激小鼠产生相应抗体的B淋巴细胞，以便后续的提取与单克隆抗体的制备，A正确；c细胞有三种种类（B细胞-B细胞，B细胞-瘤细胞，瘤细胞-瘤细胞），每种细胞染色体组数是相等的，都是四个染色体组，e细胞是杂交瘤细胞，B正确；过程2的促融方法可以采用电融合技术，这种技术能击穿细胞膜促使核融合，C错误；过程3是抗体检测及克隆产生阳性细胞的过程，此过程要进行两次，第一次是检测获得杂交瘤细胞，第二次是收获能产生单抗的杂交瘤细胞，D正确。15．细胞融合技术有着广泛应用，如图为细胞融合的简略过程。据图分析，下列叙述不正确的是（

）A．甲形成过程中，a和b需要通过细胞膜接触完成识别和结合B．乙形成过程中培养液渗透压略大于细胞质，有助于植物细胞酶解法去壁C．若a和b分别为基因型AaBB、aaBb植株的花粉细胞，则去壁后两两融合可得到4种基因型细胞D．借助单克隆抗体的导向作用能将药物定向带到癌细胞所在位置【答案】C【解析】甲是有性杂家产生的后代，其形成过程中a和b需要通过细胞膜接触完成识别和结合，A正确；乙是植物体细胞杂交产生的后代，该过程培养液渗透压略大于细胞质，有助于植物细胞酶解法去壁，防止原生质体在低渗溶液中会吸水涨破，B正确；若a和b分别为基因型AaBB、aaBb植株的花粉细胞，去壁后两两融合可以得到6种基因型的细胞，C错误；借助单克隆抗体的导向作用能将药物定向带到癌细胞所在位置，D正确。项目细胞融合原理细胞融合方法诱导手段用途植物体细胞杂交细胞膜的流动性，（细胞的全能性）去除细胞壁后诱导原生质体融合离心、电刺激、聚乙二醇等试剂诱导克服远缘杂交不亲和，获得杂种植物动物细胞融合细胞膜的流动性使细胞分散后，诱导细胞融合离心、电刺激、聚乙二醇、灭活病毒等试剂诱导制备单克隆抗体的技术之一16．下图为细胞融合的简略过程。下列相关叙述中正确的是（

）A．如果a和b分别是白菜和甘蓝的体细胞，则需要用纤维素酶和果胶酶处理这两种细胞B．如果d经分裂分化形成的是有性杂交后代，则a和b融合形成c的过程是受精作用C．如果培养d可得到单克隆抗体，则细胞d既能无限增殖也能产生抗体D．将d培养成体细胞杂交植株的过程可以说明植物细胞具有全能性【答案】ABCD【解析】植物体细胞杂交过程中需先用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞，以除去细胞壁得到原生质体，A正确；有性杂交后代是受精卵发育形成的个体，精子和卵细胞融合的过程是受精作用，B正确；单克隆抗体是由浆细胞和骨髓瘤细胞融合成的杂交瘤细胞形成的，杂交瘤细胞既能分泌抗体又能无限增殖，C正确；将植物细胞培养成植株的过程可以说明植物细胞具有全能性，D正确。17．T细胞表面的受体可以识别抗原引起免疫反应，同时还有很多辅助分子来帮助完成这一过程。此外，T细胞表面还存在负向调控的受体分子，如PD-1。当PD-1与某些特定分子治PDL1结合后，能迫使免疫细胞自杀，从而终止正在进行的免疫反应。：一些肿瘤细胞进化出了一种防御机制，它们的表面也带有PDL1，从而诱导T细胞过早地进入自我破坏程序。科学家研制出PD-1单克隆抗体，作为免疫负调控抑制剂，通过阻断PD-1与PDL1的相互作用，从而降低免疫抑制反应，进而治疗甚至治愈肿瘤。下列叙述正确的是（

）A．正常情况下，PD-1有助于防止免疫反应过度，避免发生自身免疫病B．部分T细胞会在PD-1的作用下发生细胞凋亡C．PD-1单克隆抗体不是直接作用于肿瘤，而是对免疫细胞起作用，达到抗肿瘤的目的D．体细胞中同时含有控制合成PD-1的基因和控制合成PDL1的基因【答案】ACD【解析】由题文可知，当PD-1与某些特定分子PDL1结合后，能迫使免疫细胞“自杀”，从而终止正在进行的免疫反应，有助于防止免疫反应过度，避免发生自身免疫病，A正确；部分T细胞在其表面的PD-1与PDL1发生特异性结合后，终止了免疫反应，发生了细胞凋亡，B错误。PD-1单克隆抗体与PD-1结合，对免疫细胞起作用，通过阻断PD-1与PDL1的相互作用，从而降低免疫抑制反应，进而治疗甚至治愈肿瘤，显然PD-1单克隆抗体不是直接作用于肿瘤，而是对免疫细胞起作用，达到治疗肿瘤目的的，C正确。结合题意可知，正常人体细胞中含有控制合成PD-1和PDL1的基因，D正确。18．下图是一种“生物导弹”的作用原理示意图，没有与肿瘤细胞结合的“生物导弹”一段时间后被机体清除。阿霉素是一种抗肿瘤药，可抑制DNA和RNA的合成，对正常细胞也有