烟草及烟草制品 果胶的测定

《烟草及烟草制品果胶的测定离子色谱法》研究报告安徽中烟工业公司2009年8月果胶测定行业标准研究报告关键字：烟草果胶离子色谱果胶酶摘要：比较了酸解法、酶解法、酸化酶解结合法三种前处理方法对烟草果胶水解的影响，采用离子色谱法测定水解物中的半乳糖醛酸的含量（果胶含量以半乳糖醛酸计），结果显示酸化酶解结合法可以有效水解烟草中的果胶，相对于酸解法和酶解法该法水解烟草果胶更为彻底，而且不破坏水解产物半乳糖醛酸。离子色谱法测定半乳糖醛具有灵敏度高、分离度好等优点，方法的线性相关系数为1，回收率94%～101%，RSD为0.91%。四家实验室进行了方法比对实验，结果令人满意。果胶是烟草中一种复杂的高分子聚合物，其基本结构是半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合形成的聚半乳糖醛酸。不同种类的烟草中果胶含量是不同的，通常含量在6％-12％之间，是烟草中含量较大的一类生物大分子物质[1]。烟草中的果胶类物质含量过高时会使烟草在燃吸时燃烧不完全，对烟草吸味有负面影响，同时果胶在分解时还能产生有毒物质甲醇，对卷烟的安全性不利[2]。与此同时果胶又对烟草保湿能力和柔韧性有着重要作用，因此果胶含量已成为烟草品质评价的重要指标，准确测定烟叶中的果胶含量对于烟草品质有着重要的意义[3、4]。目前国内有关果胶测定的标准有:GB/T10742-1989造纸原料果胶含量测定、NY146.11-1988果汁的测定和NY82.11-1988果胶测定。这三个标准制定时间比较早，三个标准都是先采用乙醇溶液回流除去小分子糖，再使用硫酸溶液水解果胶，咔唑比色法测定水解液中的还原糖，方法对半乳糖醛酸的选择性差，操作较为复杂且灵敏度也不高，而国际标准化组织ISO以及CORESTA也没有制定果胶测定的相关标准。目前果胶测定方法主要有两大类，一类是直接测定果胶酸含量，果胶含量以果胶酸计；一类是通过酸解或者酶解将果胶水解，采用现代分析仪器测定水解产物半乳糖醛酸含量，果胶含量以半乳糖醛酸计。第一类方法中，以重量法、容量法[5]为主，通过对果胶皂化处理，使果胶转化为果胶酸，使用氯化钙沉淀或者EDTA滴定果胶酸，测定果胶酸含量。这类方法操作步骤复杂且重复性差，目前已较少采用。第二类方法中，主要有比色法、色谱法等，其中比色法主要有咔唑比色法[6]、间-羟基联苯比色法[7]，其原理是在强酸条件下将果胶水解成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸进一步降解，通过咔唑或间-羟基联苯与半乳糖醛酸降解产物衍生化反应，进行比色测定半乳糖醛酸含量。虽然比色法对半乳糖醛酸有一定的选择性，但是中性糖对测定结果有干扰[8]。除了中性糖的干扰之外，游离态或结合态半乳糖醛酸与显色剂之间的反应也存在差异，结果导致采用比色法测定半乳糖醛酸的含量结果偏高[9-11]。色谱法测定半乳糖醛酸的方法主要有气相色谱法[12、13]、液相色谱法[14、15]离子色谱法[16、17]等。其中气相色谱法测定需要衍生化，操作复杂，采用的较少；高效液相色谱法虽然解决了选择性问题，但是只能采用示差折光检测器或者蒸发光散射检测器检测半乳糖醛酸，灵敏度不高；离子色谱法采用离子色谱柱分离半乳糖醛酸，带金电极的电化学检测器测定，方法选择性好，灵敏度高。在本研究报告中，将采用离子色谱测定果胶水解产物半乳糖醛酸，并对方法进行优化。果胶水解目前主要有三种方法，酸法[18-21]、酶法[22-24]以及酸化酶解结合法[16、25]，酸法水解需要较高浓度的酸和足够长的时间才能将果胶完全水解，酸解产物半乳糖醛酸一经释放就有降解趋势，形成内酯类物质[16,26]，因此采用酸法水解果胶定量测定半乳糖醛酸含量这种方法不是一种理想的方法[27]。酶法水解果胶是一种较好的技术，处理过程中不存半乳糖醛酸的降解，但是酶法水解需要不同类型活性的酶，包括聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、半纤维素酶，这些酶的综合作用才能有效水解果胶[13,22,23,27]。Haikel[16]比较了酸法和酶法分别水解苹果果胶，结果显示酶法水解果胶半乳糖醛酸产率达66%，而酸法不过35%左右，表明酶法比酸法对果胶聚半乳糖醛酸链有更高的解聚作用。作者还采用文献[25]方法比较了采用酶法和酸化酶解结合法测定苹果果胶、柑橘果胶、甜菜根果胶和菊苣果胶，结果显示除甜菜根果胶外，其它测定结果两种方法没明显差异。本研究报告将分别比较三种水解方法对烟草果胶测定的影响，优化烟草果胶水解方法。1、材料与方法1.1仪器与试剂ICS3000离子色谱系统、ED3000电化学检测器(美国Dionex公司),CarboPacPA-10(2mm×50mm)保护柱,CarboPacPA-10(2mm×250mm)分析柱；CSM-I旋风式样品磨（配40目筛，北京一轻研究所）；AG204分析天平，（瑞士梅特勒公司，感量0.1mg）；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);HH4数显恒温水浴锅（上海浦东物理光学仪器厂）；FD240鼓风式烘箱（德国Binder公司）；SHA-BA型水浴恒温振荡器（金坛荣华仪器制造有限公司），Milli-Q-Academic超纯水发生器(法国MILLIPORE公司)半乳糖醛酸标准品（含1个结晶水，≥97%，Sigma公司）；超纯水（电阻率≥18MΩ•cm）；50%氢氧化钠溶液(美国Fisher公司)；无水乙酸钠（优级纯，美国戴安公司）；无水乙醇、乙酸、三水乙酸钠、盐酸、苯甲酸皆为分析纯(上海国药集团)。固体果胶酶（Ruibio，酶活30u/mg，来源：Aspergillusniger，1个酶活力单位（u）定义为可在pH3.5、55℃下每小时水解果胶生成1mg半乳糖醛酸1.2试剂配制1.2.10.1mol/L乙酸/乙酸钠缓冲溶液，pH4.0；1.2.20.05、0.1、0.2、0.5、2、4、6mol/L盐酸溶液；1.2.3果胶酶溶液，300u/mL，乙酸/乙酸钠缓冲溶液配制；1.2.480%乙醇溶液；1.2.5标准溶液半乳糖醛酸标准储备液称取30mg（精确至0.1mg）半乳糖醛酸，0.1%苯甲酸溶液溶解并定容至100mL容量瓶中，定为半乳糖醛酸标准储备液。半乳糖醛酸标准储备液置于4C半乳糖醛酸标准系列溶液分别移取50L、100L、250L、1.2.6流动相超纯水作为流动相A。移取50%氢氧化钠溶液13.1mL，稀释定容至1L，配制250mmol/L氢氧化钠溶液，作为流动相B；称取无水乙酸钠82g，溶解后定容至1.3样品处理方法1.3.1酸解法将烟叶切丝，40℃下烘干，粉碎，过40目筛，置于样品瓶中备用；准确称取1g（精确至0.1mg）烟末，置于150mL圆底烧瓶中,加入60mL无机酸溶液，在沸水水浴中回流水解，冷却过滤，定容至100mL，取1.0mL至1001.3.2酶解法准确称取1g（精确至0.1mg）烟末，置于150mL磨口三角瓶中，加入100mL80%(体积分数,下同)乙醇，沸水浴回流1h以除去水溶性糖[28-31]，趁热抽滤，80%热乙醇润洗三遍。将滤片放入150mL磨口三角瓶中，使用100mL乙酸/乙酸钠缓冲溶液将残留在布氏漏斗壁上的样品残渣洗入三角瓶中，加入果胶酶溶液，55℃水浴酶解，酶解结束后布氏漏斗真空抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤3次，合并滤液定容至250mL，取1.0mL稀释至250mL后过0.451.3.3酸化酶解结合法酸化准确称取1g（精确至0.1mg）烟末，置于150mL磨口三角瓶中,加入100mL80%(体积分数,下同)乙醇，沸水浴回流1h以除去水溶性糖，趁热抽滤，80%热乙醇润洗三遍。将滤片放入150mL磨口三角瓶中，使用100mL0.05mol/L盐酸溶液将残留在布氏漏斗壁上的样品残渣洗入三角瓶中，沸水浴1h，趁热布氏漏斗真空抽滤，热水润洗三遍，滤液定容至250残渣酶水解将上述抽滤样品残渣转移至150mL磨口三角瓶中，加入100mL乙酸/乙酸钠缓冲溶液和1mL果胶酶溶液，55℃水浴振荡后布氏漏斗真空抽滤，滤液定容至250取1mL上述溶液A于100mL磨口三角瓶中，加入20mL乙酸/乙酸钠缓冲溶液和1mL果胶酶溶液，55℃水浴振荡后酶解液转移至250mL容量瓶中，加入1.0mL溶液B，以0.1%苯甲酸溶液定容，得溶液C，过0.451.4离子色谱测定方法色谱柱：CarboPacPA-10（2mm×250mm）柱温：30℃；流速：0.25mL/min；进样量：25表1淋洗液梯度洗脱程序时间(min)流动相A流动相B流动相C0.0025%60%15%15.0025%60%15%表2检测器检测电位波形时间(sec)电位(V)积分状态0.000开始0.400.10结束0.41-2.000.42-2.000.430.600.44-0.100.50-0.102、结果与讨论2.1色谱条件的选择糖类分子具有电化学活泼型及在强碱溶液中呈离子化状态，Rocklin等[31]于1983年首先报导了采用阴离子交换色谱柱分离，脉冲安培检测器测定糖的新方法。中性糖类是pKa在12-14之间的弱酸，在强碱溶液中会全部或者部分以阴离子形式存在，可以在阴离子交换柱上被保留并得到分离。考虑到半乳糖醛酸上的羧基对酸性单糖在阴子分析柱上的洗脱，因此采取了淋洗强度较大的氢氧化纳/醋酸钠淋洗液体系[16,17,32]。图1中的2张色谱图分别为:(a)标样图谱，(b)烟草水解样品图谱。由图1中的(a)图可以看出，半乳糖醛酸获得了很好的分离效果，且分析速度快仅在12min内就完成了分析。(b)图是烟草水解样品的色谱图，水解液中的中性单糖大部分在4min之内即完全出峰，且由于脉冲安培检测器具有优越的选择性使干扰因素大大降低，提高了半乳糖醛酸测定的灵敏度和准确度。(a)(b)图1离子色谱法测定半乳糖醛酸色谱图2.2标准工作曲线、线性范围及检出限按照1.2.5方法配制半乳糖醛酸标准溶液系列，离子色谱分析，用半乳糖醛酸色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得线性回归方程及其相关参数，见图2。半乳糖醛酸线性回归方程为C=0.3941×Area-0.001,相关系数为1，满足外标法定量要求。将标准溶液最低浓度重复进样5次，计算标准偏差，以此标准偏差3倍作为仪器的检出限，半乳糖醛酸检出限为4.05×10-3mg/L。图2半乳糖醛酸标准工作曲线2.3酸解法测定烟草果胶按照1.3.1方法分别采用2mol/L、4mol/L、6mol/L盐酸溶液进行烟草样品水解，结果见图3。a、b、c分别为2mol/L、4mol/L、6mol/L盐酸溶液水解半乳糖醛酸累积量随时间变化图。（a）（b）（c）图3不同浓度盐酸溶液水解烟草样品半乳糖醛酸累积量变化图从图3可以看出，不同盐酸浓度水解烟草样品的规律类似，在水解一定时间后，半乳糖醛酸累积量呈下降趋势，原因是半乳糖醛酸在酸溶液下不稳定，容易发生降解，规律与文献类似[16,26,27]。烟草内的果胶在酸作用下发生解聚生成半乳糖醛酸，水解产物半乳糖醛酸在酸作用下进一步生成内酯类物质，半乳糖醛酸的累积量是由这两步反应速率所决定，当果胶解聚作用强于半乳糖醛酸酯化作用时，半乳糖醛酸累积量呈增长趋势，而当半乳糖醛酸酯化作用强于果胶解聚作用时，半乳糖醛酸累积量呈增长趋势。为了进一步说明半乳糖醛酸在酸性条件下酯化作用，将半乳糖醛酸标准品溶解在2mol/L盐酸溶液中，沸水浴回流，结果见图4。从图4可以看出随着酸解时间的增长，半乳糖醛酸逐渐发生酯化反应，至12h仅残留26%。由于半乳糖醛酸在酸溶液中不稳定，容易发生酯化作用，因此，直接采用酸水解方法测定烟草中的果胶会造成结果偏低。图4半乳糖醛酸2N盐酸降解曲线2.4酶解法测定烟草果胶按照1.3.2方法酶解烟草样品，考察不同果胶酶酶加量对烟草果胶水解影响（酶解时间为4h），结果见图5。从图5可以看出在酶加量为400mg时，酶解基本完全。考察不同酶解时间对烟草果胶水解影响（酶加量为400mg，），结果见图6。从图6可以看出，在酶解4h后酶解基本完全，与文献[30]研究结果一致。对比酸解法和酶解法，可以看出酶解法测得的样品中果胶含量要高于酸解法。图5不同酶加量对果胶降解程度的影响图6水解时间对果胶降解程度的影响为了验证酶解法水解果胶是否完全，将酶解后的样品残渣(酶加量500mg，酶解时间4h处理后的样品残渣)转移至150mL圆底烧瓶中，加入60mL2mol/L盐酸溶液，沸水浴回流2h，测定酸解液中的半乳糖醛酸含量，结果见表3。表3结果显示烤烟烟梗样品仍能检测到含量为0.78%（占样品总重）的半乳糖醛酸，说明样品中仍然有超过0.78%的果胶未完全水解，成品卷烟的结果与烟梗类似，究其原因可能是原果胶包裹在烟草细胞壁物质中，果胶酶不容易作用到，造成不能完全水解。表3酶解法测定烟草中果胶含量样品酶解酶解残渣2N盐酸水解烤烟烟梗8.67%0.78%成品卷烟7.35%0.42%注：烤烟烟梗样品为原梗，成品卷烟为一品黄山。2.5酸化酶解结合法测定烟草果胶植物果胶分别以原果胶、果胶酯酸、果胶酸三种形态存在植物组织中，原果胶是与纤维素、半纤维素结合在一起的高度甲酯化的聚半乳糖醛酸，只存在于细胞壁中，不溶于水[5]。烟叶成熟后细胞壁中仍然会存在一定量原果胶，原果胶与细胞壁物质纠缠在一起，通过酶作用很难进行水解完全，而且在原果胶中，聚半乳糖醛酸可被甲醇部分酯化，并以金属桥（特别是钙离子）与多聚半乳糖醛酸分子残基上的游离羧基相连接，造成原果胶结晶度高，不易水解。不溶于水的原果胶通过酸作用可以破坏金属离子桥（离子键），增加原果胶的亲水性，与此同时通过酸化作用可以破坏细胞壁，使包裹在里面的原果胶充分裸露出来，有利于果胶酶的作用。有鉴于此，采用0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L盐酸溶液酸化处理烟草样品（沸水浴回流1h），然后使用果胶酶分别水解残渣和酸化液，残渣酶解完后使用2mol/L盐酸水解，离子色谱测定半乳糖醛酸含量（占样品总重），结果见表4。由表4可以看出，采用不同浓度的盐酸处理烟草样品，基本未造成果胶的水解，在0.05mol/L条件下未检出，0.05mol/L以上浓度的仅造成微弱的水解。采用盐酸溶液处理样品，烟草中的果胶并未能全部溶解，从表4可以看出仍然有大量的果胶残存在残渣中，因此必须对盐酸提取液和残渣都进行酶解才能不至于使测定结果偏低。为了验证果胶酶对盐酸溶液提取后的残渣酶解完成程度，将酶解后的样品残渣转移至150mL圆底烧瓶中，加入60mL2mol/L盐酸溶液，沸水浴回流2h，测定该酸解液中的半乳糖醛酸含量，结果显示半乳糖醛酸仅有微量残留，说明采用盐酸酸化后进行酶解，残渣中的果胶水解比较彻底。表4酸化酶解法测定烟草中果胶含量酸化液酸化液酶解残渣酶解酶解残渣盐酸水解0.05N-3.95%5.80%0.09%0.1N0.07%3.88%5.98%0.10%0.15N0.08%3.74%6.11%0.08%0.2N0.09%4.02%5.96%0.07%0.5N0.19%3.75%6.12%0.07%注：-为未检出；实验样品为烤烟原梗；酸化液取1mL进行酶解，酶解条件为100mg果胶酶、酶解时间4h；残渣酶解条件为400mg酶加量，酶解时间4h。上述酶解是对酸化液和残渣分别进行酶解的，下面将对酸化液和残渣同时酶解，采用0.05mol/L盐酸和0.59mol/L柠檬酸溶液分别酸化处理样品，沸水浴回流1h，酸化完毕后冷却。盐酸酸化液使用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至中性，加入pH4柠檬酸/柠檬酸钠缓冲盐；柠檬酸酸化液直接加入一定比例的柠檬酸钠，使溶液pH值为4。分别加入400mg果胶酶，55℃水浴水解，离子色谱测定半乳糖醛酸含量，结果见表5。从表5可以看出，对酸化液和残渣同时酶解，酶解不能完全。使用硫酸苯酚法[5]监测酸化液中还原糖，苯酚溶液呈棕黑色，说酸化液中存在一定量的还原糖，这些还原糖是由酸水解烟草中多糖物质产生的，这些糖分的存在对于果胶酶有底物抑制作用[29,30,33]，降低了果胶酶的活性，以致酶解不能完全。为了顺利对含糖量较高的酸化液进行有效的酶解，采取的方法是对酸化液进行稀释，降低其中的糖分含量，使糖不至于抑制果胶酶活性，取1mL酸化液加入缓冲溶液后，溶液在硫酸苯酚中显淡黄色，说明其中的糖分浓度已经很低，这样能够使果胶有效表5样品酸化酶解测定结果酶解酶解残渣盐酸水解盐酸酸化6.58%0.79%柠檬酸酸化7.28%0.68%注：实验样品为烤烟原梗。综合上述分析，采用0.05mol/L盐酸酸化烟草样品（注：实验样品为烤烟成品梗丝），再分别对酸化液和残渣进行酶解，合并酶解液，离子色谱进行定量分析。分别考察不同酶加量（酶解时间2h）和酶解时间（酶加量10mg）对残渣中果胶水解影响，结果见图7、8；不同酶加量（酶解时间1h）和酶解时间（酶加量10mg）对酸化液中果胶水解影响，结果见图9、10。从图7可以看出随着酶用量的增加，半乳糖醛酸的测定量也增加，当加酶量>5mg后，半乳糖醛酸的测定量几乎保持不变，说明10mg果胶酶(酶活30u/mg)就足以酸化后残渣中的果胶水解出来。从图8可以看出随反应时间的增加，半乳糖醛酸的测定量也变大，直到t>90min后才趋于平缓，因此确定2h为果胶酶酶解果胶水解时间。图9规律与图7类似，酶加量>5mg后，半乳糖醛酸的测定量几乎保持不变，图10中酸解液中果胶在酶解时间30min之后酶解完全。综合上述条件优化的结果，确定酶解条件。残渣最佳酶解条件：1g烟末残渣、100mLpH4乙酸/乙酸钠缓冲液、10mg果胶酶、55℃水浴水解2h；酸化液最佳酶解条件：1mL酸化液、20mLpH4乙酸/乙酸钠缓冲液、10mg果胶酶、55图7酶加量对残渣中果胶水解影响图8酶解时间对残渣中果胶水解影响图9酶加量对酸化液中果胶水解影响图10酶解时间对酸化液中果胶水解影响2.6测定结果的计算样品中的半乳糖醛酸含量按照式（1）进行计算，果胶含量以半乳糖醛酸计。X=k（C-C0）V×100%…………（1）m(1-W)式中，X——试样中的果胶含量，%；C——测试样品溶液中半乳糖醛酸浓度，单位为毫克每升（mg/L）；C0——空白样品溶液中半乳糖醛酸浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V——溶液C的体积，单位为升（L）；m——试样质量，单位为毫克（mg）；W——试样含水率，%；k——溶液A体积与酶解取样体积之比。2.7方法重复性和回收率按照2.5确定的前处理方法，处理烟草样品，重复测定五次，考察重复性。果胶含量(以半乳糖醛酸计)的测定值分别为10.43%、10.54%、10.46%、10.44%、10.66%，平均测定值为10.50%，RSD为0.91%，表明本法精密度较高。在样品中加入纯果胶标准品（Sigma,P9135,半乳糖醛酸含量74%），考察方法的回收率，结果见表6。结果显示回收率为94%-101%，回收率较高，满足定量分析要求。表6果胶回收率果胶添加量(mg)换算成半乳糖醛酸(mg)测定值（mg）回收率(%)00105.0-52.638.9141.794.399.173.3179.1101.0200.4148.3249.097.12.8方法适用性验证分别按照2.5确定的前处理方法处理烤烟、香料烟、白肋烟和成品卷烟样品，样品酸化液分别酶解1h和2h以考察酶解条件的适用性，样品残渣酶解完成后使用2mol/L盐酸水解以考察酶解是否完全，结果见表7。从表7可以看出酸化酶解1h和2h没有明显区别，不同样品残渣酶解也比较完全，说明2.5确定方法对于不同种类的样品皆能适用。表7方法适用性验证酸化液酶解1h酸化液酶解2h酶解残渣盐酸水解烤烟5.49%5.47%0.04%香料烟5.40%5.36%0.05%白肋烟3.77%3.75%0.13%成品卷烟4.66%4.50%0.06%2.9比对实验结果采用所建立的方法，分别在安徽中烟、上海烟草集团、江西中烟、广东中烟4家实验室进行比对实验，选取比对样品为烤烟烟梗（梗丝）、烤烟（07皖南C3FA）、白肋烟（07建始B1F）、香料烟（04新疆AB级）、烤烟型卷烟（一品黄山）、混合型卷烟（都宝）共计6个典型样品，每个样品分别由两个实验人员独立测定，共计获得8个比对实验数据，结果见表8表8比对实验结果样品名称安徽上海江西广州变异系数12121212烟梗10.54%10.46%10.33%10.13%10.63%10.43%10.37%10.52%1.46%烤烟8.09%7.95%8.16%8.08%7.52%7.81%7.83%8.02%2.60%白肋烟8.15%7.98%7.63%7.46%8.12%8.20%7.79%7.95%3.36%香料烟7.22%7.38%7.10%6.81%6.46%6.70%6.99%7.11%4.29%一品黄山8.33%8.16%8.07%7.83%8.03%8.23%7.67%7.85%2.77%都宝9.29%9.01%8.65%8.87%9.00%8.83%8.92%9.06%2.09%比对实验结果表明，应用本标准确定的果胶测定方法，不同实验室得到了较为一致的分析结果，对不同类型的烟草样品测定结果皆令人满意。3、结论建立了一种离子色谱法测定烟草中果胶的分析方法，优化了酸化酶解结合法水解烟草中果胶的前处理条件，本法选择性强,重复性好,回收率高,可用于烟叶果胶含量的批量检测。参考文献1.Layten,D.andMark,T.N.Tobaccoproduction,chemistryandtechnology[M].北京:化学工业出版社，2003.255.2.闫克玉.烟草化学[M].郑州:郑州大学出版社,2002.50.3.金闻博,戴亚.烟草化学[M].北京:清华大学出版社,1993.53.4.李汉超,王淑娴.烟草、烟气化学及分析[M].郑州:河南科学技术出社,1991.87.5.大连轻工业学院,华南理工大学,郑州轻工业学院,等.食品分析[M].北京:中国轻工业出版社,1999.213.6.Dische,Z.Anewspecificcolorreactionofhexuronicacids.JournalofBiologicalChemistry,1947(167),189-198.7.Blumenkrantz,N.andAsboe-Hansen,G.Anewmethodforquantitativedeterminationofuronicacids.AnalyticalBiochemistry,1973(54),484-489.8.Kinter,P.K.andVanBuren,J.P.Carbohydrateinterferenceanditscorrectioninpectinanalysisusingthem-hydroxydiphenylmethod.JournalofFoodScience,1982(47),756-764.9.Penman,A.andSanderson,G.R.Amethodforthedeterminationofuronicacidsequenceinalginates.CarbohydrateResearch,1972(25),273-282.10.Scott,R.W.Colorimetricdeterminationofhexuronicacidsinplantmaterials.AnalyticalChemistry,1979(51),936-941.11.Matsuhashi,S.andHatanaka,C.Differencebetweenthefreeandconjugatedgalacturonateresiduesintheircolorreactionwithcarbazoleorm-hydroxybiphenylreagents.BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,1992(56),1141-1153.12.Jones,T.M.andAlbersheim,P.Agasliquidchromatographicmethodforthedeterminationofaldoseanduronicacidconsti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