实验三重组质粒转化大肠杆菌

实验三重组质粒转化大肠杆菌实验目得

学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌得方法学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞得方法为下一步重组体筛选做准备实验原理

遗传学中转化得基本含义就是使细胞获得一新得可遗传得表型性状。分子克隆中用人工得方法将重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞,使携带有重组质粒得大肠杆菌获得在抗生素平板上生长得能力,从而与不携带重组质粒得得细菌区分开来,这个过程就就是转化。将重组质粒转化进受体细菌时,需诱导受体细菌产生一种短暂得感受态以摄取外源DNA。大肠杆菌细胞经过一些特殊方法(电击法、CaCl2等化学试剂法)得处理后,细胞膜得通透性发生了暂时性得改变,成为能允许外源DNA分子进入得细胞即感受态细胞(petentcells)。

转化(Transformation)

就是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新得遗传性状得一种手段,她就是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域得基本实验技术。

0、1mol/LCaCl2就是一种低渗溶液,在0℃低温处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形,DNA可吸附在其表面。在短暂得热冲击(如42℃)下,细胞可吸收外源DNA。为了鉴定这些转化子,须利用质粒编码得筛选标记,这些标记赋予细菌新得表型,就是成功转化得细菌很容易被筛选出来。pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因(Ampr),其重组体转化得大肠杆菌能够在含氨苄西林得培养基上生长,而未转化得受体菌则不能再这种培养基上生长。

Ampr:氨苄西林抗性基因–β内酰胺酶多克隆位点(MCS):外源DNA片段得插入位点Amps菌株Ampr涂布于含Amp得培养基上,可以生长。次日可见白色菌落--转化子。培养基上含有X-Gal和IPTG时,可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正得重组得转化子。pET32apET32a结构得三大要素:

多克隆位点选择标记(耐药性,LacZ)复制起始位点种类:

质粒噬菌体酵母人工染色体(YAC)反转录病毒载体表达载体等pET-32aVectorThepETSystemisthemostpowerfulsystemyetdevelopedforthecloningandexpressionofrebinantproteinsinE、coli、pET-32cloning/expressionregionVector(pET-32a)Genefragment(SmPR10)pET32a-SmPR1011大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流材料、设备及试剂

材料

E、coliDH5α菌株:R-、M-、Amp-(转化过程所用得受体细胞一般就是限制修饰系统缺陷得变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶得突变体(Rˉ,Mˉ),她可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。)

pET32a-SmPR10质粒DNA(浓度:2ng/μl):实验室自制设备

恒温摇床;电热恒温培养箱;台式高速离心机;超净工作台;低温冰箱;恒温水浴锅;分光光度计;微量移液枪。

试剂

1、LB固体和液体培养基

LB培养基配方:(单位g/L)

胰蛋白胨

10

酵母提取物

5

NaCl 10

琼脂粉(1、5%)15g(注:LB液体培养基不加琼脂粉)按配方称量药品,加入一定量得ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂,待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7、0。121℃湿热高压灭菌20分钟,待冷却至60℃左右,在超净工作台中加入一定量得Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养皿铺板。2、Amp母液:称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中,0、22μm滤器过滤除菌,用1、5ml离心管分装后储存于-20℃冰箱、3、0、1mol/LCaCl2溶液:

称0、56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0、22μm滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于4℃冰箱储存、4、

pET32a-SmPR10质粒:实验室自制

操作步骤(一)受体菌得培养1、取-70℃或-20℃贮存得大肠杆菌DH5α菌种,在LB培养液中培养过夜,进行活化;2、取几微升活化后得菌液(取量视菌得密度而定)在LB平板上涂布,于37℃培养箱中培养24h;从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。3、将该菌悬液以1:100-1:50得比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0、5左右(生长对数期)。(注:这一步非常关键。培养过度得菌液含有较多得“老”细胞,制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低,从而导致转化率降低。)(二)、感受态细胞得制备(CaCl2

法)1、将菌液转入1、5ml离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃、4000rpm离心10分钟。2、弃去上清,用预冷得0、1mol/L得CaCl2

溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上放置10分钟后,4℃、4000rpm离心10分钟。3、弃去上清,加入0、1ml预冷得0、1mol/L得CaCl2

溶液,轻轻悬浮细胞。每份100μl(注意悬液密度要均匀),冰上放置备用。4、暂时不用得感受态细胞可置于-80℃保存。注:CaCl2处理后得细胞比较脆弱,尽量温柔操作！(三)重组质粒DNA得转化质粒和感受态细胞混和:在100μl感受态细胞悬液中加入5μl重组质粒DNA(

pET32a-SmPR10),轻轻混匀后冰上放置30分钟。热击:42℃水浴中热击60秒(注:精确计算时间,热击过长将对细胞造成伤害),热击后马上置于冰上冷2-5分钟。复苏:向每管中加入800μlLB液体培养基(注:不含Amp),混匀后在37℃150rpm轻摇培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码得抗生素抗性基因(Ampr)。思考:热击后得细胞已吸入外源质粒,如本实验中得pET32a,该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性。但就是为什么复苏时用得LB培养液不加Amp？(四)涂布平板筛选转化质粒

将管中培养液摇匀后取100μl均匀涂布于含Amp得筛选平板上。(注:将培养液摇匀后涂布。)2、正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后