PCR反应的主要成份全面阐述

第第页PCR反应的紧要成份全面叙述PCR反应中的紧要成份引物、4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、Mg2+、模板、TaqDNA聚合酶、反应缓冲液五部分构成。各个组份都能影响PCR结果的好坏，下面认真分析：1.引物PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决议。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵奉并服从下列原则：（1）引物长度约为16—30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较挥霍，且难以合成。（2）引物中G+C含量通常为40%—60%，可按下式大略估量引物的解链温度Tm＝4（G+C）+2（A+T）。（3）四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。（4）引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摇摆产生的不配对。（5）在引物内，尤其在3端应不存在二级结构。（6）两引物之间尤其在3端不能互补，以防显现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。（7）引物5端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素等。通常应在5端限制酶位点外再加1—2个保护碱基。（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物自身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。（9）简并引物应选用简并程度低的密码子，例如选用只有一种密码子的Met，3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。（10）一般PCR反应中的引物终浓度为0.2—1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。利用紫外分光光度计，可精准明确计算引物浓度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：Xmol/L＝OD260/A（16000）+C（70000）+G（12000）+T（9600）X：引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。2.4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）（1）dNTP应用NaOH将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。（2）dNTP原液可配成5—10mmol/L并分装，—20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20—200μmol/L。（3）理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应当相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足显现的错误掺入。3.Mg2+（1）Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。（2）通常Mg2+浓度范围为0.5—2mmol/L.对于一种新的PCR反应，可以用0.1—5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行准备试验，选出最适的Mg2+浓度。（3）在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。4.模板（1）PCR反应必需以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子（线状分子比环状分子的扩增效果稍好）。（2）就模板DNA而言，影响PCR的紧要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102—105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少。（3）灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。（4）模板量过多则可能加添非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。5.TaqDNA聚合酶一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。现在人们又发现很多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出过错率，一般PCR中出过错率为2×10—4核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100μlPCR反应中，1.5—2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可依据DNA、引物及其它因素的更改进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性加添，过少则使产量降低。反应结束后，假如需要利用这些产物进行下一步试验，需要预先灭活TaqDNA聚合酶，灭活TaqDNA聚合酶的方法有：（1）PCR产物经酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。（2）加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。（3）99—100℃加热10min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。6.反应缓冲液（1）反应缓冲液一般含10—50mmol/LTris·Cl（20℃下pH8.3—8.8），50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+。Tris·Cl在20℃时pH为8.3—8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8—7.8.50mmol/L的KCl有利于引物的退火。（