食品中沙门氏菌的快速检测测试片法

1食品中沙门氏菌的快速检测测试片法1范围本文件规定了沙门氏菌(Salmonella)的快速检测-测试片法。本文件适用于食品及加工环境涂抹样品中沙门氏菌的快速检验。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB19489实验室生物安全通用要求3设备和材料3.1电子天平:感量0.001g。3.2拍击式均质器。3.3振荡器。3.4恒温培养箱:36℃±1℃、42℃±1℃。3.5无菌锥形瓶:容量500mL、250mL。3.6无菌量筒:容量50mL。3.7无菌均质杯、无菌均质袋。3.8无菌吸管:1mL(0.01mL刻度)、10mL(0.1mL刻度)或移液器及吸头(0.1mL~1mL)。3.9无菌试管:10mm×75mm。3.10pH计或精密pH试纸:精密度0.1。3.11无菌接种环:10μL(直径约3mm)、1μL以及接种针。3.12高压蒸汽灭菌器。3.13涡旋混合器。4培养基和试剂4.1沙门氏菌增菌液:见附录A.1。4.2氯化镁孔雀绿大豆胨(RVS)增菌液:见附录A.2。4.3HandyPlate®沙门氏菌测试片。4.4HandyPlate®沙门氏菌确认反应片。4.5无菌磷酸盐缓冲液,见附录A.3。4.6无菌生理盐水,见附录A.4。24.71mol/LNaOH溶液,见附录A.5。4.81mol/LHCl溶液,见附录A.6。4.9EHK®HK-N-PBS一次性采样管。5检验程序yy(≤10yy(≤10yyyyyyy图1沙门氏菌测试片法检验程序6操作步骤6.1增菌6.1.1无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mL沙门氏菌增菌液的无菌均质杯或其他合适容器内,以8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mL沙门氏菌增菌液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH,用1mol/LNaOH溶液或1mol/LHCl溶液调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶或其他合适容器内(如无菌均质杯本身具有无孔盖,可不转移样品)。如使用无菌均质袋,可直接进行培养,于36℃±1℃培养18h~24h。36.1.2对于乳粉,无菌操作称取25g样品,缓缓倾倒在广口瓶或无菌均质袋内225mL沙门氏菌增菌液的表面,勿调节pH,也暂不混匀,室温静置1h后再混匀,置于36℃±1℃培养18h~24h。6.1.3冷冻样品如需解冻,取样前在45℃以下解冻不超过15min,或在2℃~5℃冰箱内缓慢解冻不超过18h。6.1.4对于微生物含量较高的样品(>104CFU/g)(如生的或未加工),轻轻摇动上述培养过的沙门氏菌增菌液,移取0.1mL,转种于10mLRVS增菌液内,混匀后于42℃±1℃培养18h~24h。对于微生物含量较低的样品(≤104CFU/g)(如深加工),可跳过此步骤。6.1.5加工环境涂抹样品:取1支HK-N-PBS一次性采样管,取出拭子在食品加工接触部位沿不锈钢采样板擦拭采样表面(100cm2)从两个方向(从左到右,然后从上到下)覆盖整个区域。将拭子放回含缓冲液的采样管,涡旋混合以充分释放微生物。将采样管内的10mL缓冲液加入含有225mL沙门氏菌增菌液的无菌均质袋(或其他合适容器)中,用均质器均质1min~2min,充分混匀。36℃±1℃培养18h~24h。6.1.6实验室应根据需要设置阳性对照、阴性对照,定期对检验过程进行质量控制。宜选用肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)FSCC(T)215456或等效标准菌株作为阳性对照菌株,大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)FSCC(T)149009或等效标准菌株作为阴性对照菌株。6.2接种培养6.2.1将测试片置于平坦表面处,揭开上膜。使用10μL无菌接种环取1环混匀后的增菌液在沙门氏菌测试片上划线。用无菌吸管或移液器吸取1mL无菌水或无菌生理盐水于沙门氏菌测试片内,静置至少1min以使培养基凝固。6.2.2将测试片正面朝上,堆叠不超过20张,放入培养箱中,于36℃±1℃培养24h±2h。6.3判读观察测试片上生长的菌落,沙门氏菌可疑菌落为有黄色晕圈的红色菌落,有或无气泡,其他蓝绿色、无色、棕黑色等菌落均为非沙门氏菌。将可疑菌落用记号笔标记。6.4确认6.4.1确认反应片的培养揭开上膜,将确认反应片与培养基贴合,将上膜轻轻盖下,用手轻轻滑动,赶走培养基区域内的气泡,使确认反应片与上膜和下层凝胶完全贴合,于36℃±1℃培养4h~5h。6.4.2确认反应片的判读取出带确认反应片的沙门氏菌测试片,观察标记菌落的颜色。若标记菌落变为蓝绿色、蓝黑色,则判为沙门氏菌,其他颜色为非沙门氏菌。7结果与报告综合沙门氏菌测试片和确认反应片的结果,报告25g(mL)样品或100cm2加工环境涂抹样品中检出或未检出沙门氏菌。8废弃物处置检测过程中产生的废弃物按照GB19489的相关要求进行处置,含微生物的废弃物应121℃高压蒸汽灭菌30min后再按相关规定处置。4(规范性)培养基和试剂A.1沙门氏菌增菌液A.1.1成分A.1.1.1酪蛋白胨10.0gA.1.1.2酵母浸粉8.0gA.1.1.3葡萄糖3.0gA.1.1.4甘露醇2.0gA.1.1.5麦芽糖1.5gA.1.1.6L-赖氨酸盐酸盐0.5gA.1.1.7氯化钠5.0gA.1.1.8胆盐1.5gA.1.1.9磷酸二氢钾1.5gA.1.1.10丙酮酸钠3.0gA.1.1.11可溶性淀粉1.0gA.1.1.12新生霉素钠0.012gA.1.1.13孔雀石绿0.015gA.1.1.14蒸馏水1000mLA.1.2制法称取37.0g干粉溶解于1L蒸馏水中,121℃高压蒸汽灭菌15min。增菌液25℃时的pH为7.2±0.2。A.2RVS增菌液A.2.1成分A.2.1.1大豆蛋白胨4.5gA.2.1.2氯化钠7.2gA.2.1.3磷酸二氢钾1.26gA.2.1.4磷酸氢二钾0.18gA.2.1.5氯化镁(含6个结晶水)28.6gA.2.1.6孔雀绿0.036gA.2.1.7蒸馏水1000mLA.2.2制法将各成分加入蒸馏水中搅匀后加热溶解,必要时调节pH,定量分装于试管中,115℃高压蒸汽灭菌15min。增菌液25℃时的pH为5.2±0.2。A.3无菌磷酸盐缓冲液A.3.1成分A.3.1.1磷酸二氢钾34.0g5A.3.1.2蒸馏水500mLA.3.2制法A.3.2.1贮存液:称取34.0g磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/LNaOH溶液调节pH至7.2±0.1,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱中。A.3.2.2稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃高压蒸汽灭菌15min。A.4无菌生理盐水A.4.1成分A.4.1.1氯化钠8.5gA.4.1.2蒸馏水1000mLA.4.2制法称取8.5g氯化钠加入1000mL蒸馏水中,搅拌至完全溶解,分装后,121℃高压蒸汽灭菌15min,备用。A.51mol/LNaOH溶液A.5.1成分A.5.1.1NaOH40.0gA.5.1.2无菌蒸馏水1000mLA.5.2制法称取40gNaOH溶