高中生物同步备课系列【备学案】3.2.1 基因工程的基本操作程序 导学案（教师版）-人教2019版选择性必修3

第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序（第1课时）导学案【生命观念】阐明基因工程的原理和基本操作程序。【科学思维】针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。【教学重点】1.基因工程基本操作程序的四个步骤。2.DNA片段的扩增及电泳鉴定。【教学难点】1.利用PCR获取和扩增目的基因。2.DNA片段的扩增及电泳鉴定。一、目的基因的筛选和获取目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因，根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因。目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌）、人胰岛素基因、人干扰素基因等。1.筛选合适的目的基因（1）方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。（2）实例：苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害；苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关；科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白也有较为深入的了解。因此，筛选Bt基因作为培育转基因抗虫棉的目的基因。2.利用PCR获取和扩增目的基因（1）PCR：聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。（2）DNA体内复制的条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸引物：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。体内复制的引物为RNA单链。（3）DNA体外复制（PCR）的条件参与的组分在DNA复制中的作用90℃以上高温打开DNA双链（变性）DNA母链提供DNA复制的模板*4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料耐高温的DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸缓冲液（含Mg2+)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶注意：体外复制的引物一般为DNA单链。（4）扩增的过程①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链；②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。如此重复循环多次，由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。【思考】用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。3.获取目的基因的其他方法（1）构建基因文库来获取目的基因：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。①基因组文库：含有一种生物的全部基因。提取某种生物的全部DNA→用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段→将DNA片段与载体连接形成基因表达载体→导入受体菌中储存→基因组文库。②部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA→在反（逆）转录酶作用下形成单链互补DNA→在DNA聚合酶作用下形成双链DNA片段→与载体连接形成基因表达载体→导入受体菌中储存→cDNA文库。基因组DNA文库与cDNA文库的比较：文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子（位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以（2）利用化学方法人工合成①需要仪器：DNA合成仪。②适用目的基因类型：要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知；③不需要模板。二、基因表达载体的构建（核心）1.操作目的：让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的构成（1）启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游（首端），紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子。诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达。（2）终止子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游（尾端），标志着转录的停止。（3）标记基因①作用：便于重组DNA分子的筛选。②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。（4）目的基因：如Bt基因。（5）复制原点作用：使能完成自主复制。3.基因表达载体的构建【思考】将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞（1）花粉管通道法（受体细胞：受精卵）①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。（2）农杆菌转化法①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。②特点：a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。③实验思路（过程）：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。④具体转化方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。2.将目的基因导入动物细胞——显微注射法（1）受体细胞：受精卵。因为受精卵容易表现出全能性。（2）过程：构建基因表达载体并提纯→利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中→早期胚胎培养→胚胎移植→获得具有新性状的动物。3.将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法（1）受