蛋白质的分离纯化

关于蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化透析和超过滤超速离心层析（色谱）

(chromatography)电泳

(electrophoresis)第2页,共42页，星期六，2024年，5月1透析和超过滤

P302第3页,共42页，星期六，2024年，5月2超速离心

P302第4页,共42页，星期六，2024年，5月

基本原理：层析由流动相和固定相组成样品作为流动相流过固定相各组分在两相中分布程度不同各成分迁移率不同分离3层析（色谱）（Chromatography）

P148第5页,共42页，星期六，2024年，5月两相：固定相（静相）和流动相（动相）有效分配系数：第6页,共42页，星期六，2024年，5月层析按流动相：气相、液相色谱等；按操作形式不同：纸层析、薄层层析、柱层析等；按分离机制：凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、吸附层析等。第7页,共42页，星期六，2024年，5月3.1纸层析

（Filter-paperchromatography）相对迁移率

P151第8页,共42页，星期六，2024年，5月3.2薄层层析

（Thin-layerchromatography）

P152第9页,共42页，星期六，2024年，5月3.3柱层析第10页,共42页，星期六，2024年，5月①凝胶过滤层析

(分子排阻层析、分子筛层析）

（Gel-filtrationchromatography）根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。

P303第11页,共42页，星期六，2024年，5月介质：凝胶颗粒（多孔的网状结构）交联度或孔度（网孔大小）——凝胶的分级分离范围交联葡聚糖——SephadexG-50（1500-30000）琼脂糖——Sepharose或Bio-GelA聚丙烯酰胺——Bio-GelP第12页,共42页，星期六，2024年，5月原理：第13页,共42页，星期六，2024年，5月②离子交换层析

（Ion-exchangechromatography）根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。介质：离子交换树脂溶液中的离子与树脂上的带电基团进行交换反应；各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同；在洗脱过程中，各种离子迁移率不同，达到分离的目的。

P152和310第14页,共42页，星期六，2024年，5月第15页,共42页，星期六，2024年，5月第16页,共42页，星期六，2024年，5月第17页,共42页，星期六，2024年，5月第18页,共42页，星期六，2024年，5月茚三酮反应：生成紫色物质脯氨酸和羟脯氨酸生成黄色物质

氨基酸的定性定量第19页,共42页，星期六，2024年，5月第20页,共42页，星期六，2024年，5月

根据蛋白质与特异的配体相互作用来分离的。蛋白质＋配体蛋白质配体复合物③亲和层析

(Affinitychromatography)

P313第21页,共42页，星期六，2024年，5月第22页,共42页，星期六，2024年，5月第23页,共42页，星期六，2024年，5月第24页,共42页，星期六，2024年，5月第25页,共42页，星期六，2024年，5月④高效液相层析（High-Performanceliquidchromatography,HPLC）

P154和314也分为凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等特点：固定相支持剂颗粒细采取高压，洗脱速度增大第26页,共42页，星期六，2024年，5月第27页,共42页，星期六，2024年，5月4电泳(Electrophoresis)在外电场存在下，利用蛋白质分子携带的净电荷不同以分离混合物ArneTiselius获1948年诺贝尔化学奖

P307第28页,共42页，星期六，2024年，5月4.1凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶（蛋白质和多核苷酸）琼脂糖凝胶（核酸）第29页,共42页，星期六，2024年，5月电泳仪水平电泳槽垂直电泳槽第30页,共42页，星期六，2024年，5月聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）不连续：浓缩胶和分离胶电泳迁移率决定于所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。+凝胶加样

P309第31页,共42页，星期六，2024年，5月巯基乙醇：打开二硫键。SDS：变性剂，破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。

SDS以其氢键与蛋白质分子的侧链结合成复合体。①带有很多负电荷——远远超过蛋白质分子原有电荷②改变了蛋白质单体分子的构象：近似雪茄烟形的长椭圆棒，

短轴长度相同，长轴长度随蛋白质的相对分子质量成正比例变化。迁移率主要取决于蛋白质相对分子量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）第32页,共42页，星期六，2024年，5月第33页,共42页，星期六，2024年，5月迁移率第34页,共42页，星期六，2024年，5月4.2等电聚焦电泳高分辨率的蛋白质分离技术。在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场的作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的pI有0.02pH单位的差别就能分开。

P310第35页,共42页，星期六，2024年，5月第36页,共42页，星期六，2024年，5月等电聚焦电泳电泳时，每种蛋白迁移至与它的pI相一致的pH处加入蛋白样品电场作用下在凝胶中建立稳定的一个pH梯度第37页,共42页，星期六，2024年，5月第38页,共42页，星期六，2024年，5月等电聚焦电泳+SDS-PAGE第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；再沿垂直的方向进行分子量的分离.4.3双向电泳pI降低分子量减小