1.2-基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用

载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。

才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。一、目的基因的获取1目的基因主要是编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2获取目的基因的常用方法：1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成1.从基因文库中获取目的基因1.基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2.基因文库的种类:基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA

许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA基因的结构非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子启动子原核真核原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区②调控遗传信息表达,上游的RNA聚合酶结合位点:基因结构真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。与RNA聚合酶结合位点基因结构原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的，边_________边_________编码区是间隔的、_____的，先_____后_____相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的连续不连续编码区非编码转录翻译转录翻译基因文库的构建方法①基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体基因组文库导入受体菌中储存②cDNA文库的构建-----逆转录法：提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存思考？真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码序列。即不含非编码区和内含子基因组DNA文库与cDNA文库的比较

文库类型cDNA文库

基因组文库

文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）

基因多少

物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性④从基因文库中得到目的基因的方法2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。2原理：DNA复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶多聚酶链式反应体外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程aDNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一2、利用PCR技术扩增目的基因PCR技术的操作过程PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等PCR技术的操作过程aDNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一人工合成法反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成

在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因表达载体启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端注意：①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。三、将目的基因导入受体细胞1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。3目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。1、目的基因导入植物细胞的方法（1）农杆菌转化法①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达③过程：1、目的基因导入植物细胞的方法（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞①操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。②

钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um。③适用：通常是单子叶植物1、目的基因导入植物细胞的方法（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞②

特点:十分简便经济。③例：转基因抗虫棉2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法①程序目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞①微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少②常用菌：大肠杆菌③常用法：Ca2+处理获得感受态细胞④过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态

细胞感受态细胞吸收DNA表达载体与感受态细胞混合小结：将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？1真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测1、鉴定——分子水平的鉴定转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法——DNA分子杂交技术变性变性1、鉴定——分子水平的鉴定变性方法——分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N14N1、鉴定——分子水平的鉴定提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质

出现杂交带脱分化组织培养2、鉴定——个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。思考？不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？课堂练习1、有关基因工程的叙述中，错误的是()A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来

B、限制性内切酶用于目的基因的获得

C、目的基因须由运载体导入受体细胞

D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A课堂练习2、下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D课堂练习3、有关基因工程的叙述正确的是（）

A、限制酶只在获得目的基因时才用

B、重组质粒的形成在细胞内完成

C、质粒都可作为运载体

D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D【拓展深化】

工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在操作程序2中用到。课堂练习4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是

（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因与运载体结合

C、将目的基因导入受体细胞

D、目的基因的检测和表达C【拓展深化】只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对课堂练习即时应用(随学随练，轻松夺冠)5．(2009年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是(

)A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达D基因工程高考专题

1、下列是同种限制性内切酶切割产生的粘性末端的是（）A．①②B．②③C．③④D．②④E。⑤⑥E2.(2008)已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有一个酶切位点被该酶切断，则理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是A.3B.4C.9D.12C4、下面图中a、b、c、d代表的结构正确的是（）A．a--质粒RNAB．b--限制性外切酶C．c--RNA聚合酶D．d—外源基因

D

5、我国科学工作者经研究发现一种生活在棉铃虫消化道内的苏云金芽孢杆菌能分泌一种毒蛋白使棉铃虫致死，而此毒蛋白对人畜无害。通过科技攻关，我国科工作者已成功地将该毒蛋白基因导人棉花植株体内并实现了表达。由于棉铃虫吃了新品种“转基因抗虫棉”植株后就会死亡，所以该棉花新品种在近年推广后，已收到了很好的经济效益，请据以上所给材料回答下列问题：(1)害虫抗药性的增强是

的结果(2）“转基因”抗虫棉新品种的培育应用了新技术(3)在培育新基因抗虫棉新品种过程中，所用的基因的“剪刀”是

，基因的“针线”是

，基因的“运载工具”是

(5)“转基因抗虫棉”抗害虫的遗传信息传递过程可以表示为

(6)该科技成果在环保上的重要作用是

自然选择基因工程(或DNA重组技术)限制酶DNA连接酶；运载体抗虫基因mRNA毒蛋白减少农药对环境的污染，保护了生态环境7、（2005·广东生物·22）以下有关基因工程的叙述，正确的是（）

A、基因工程是细胞水平上的生物工程

B、基因工程的产物对人类部是有益的

C、基因工程产生的变异属于人工诱变

D、基因工程育种的优点之一是目的性强D6、镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是（）

A、解旋酶B、DNA连接酶

C、限制性内切酶D、RNA聚合酶C8、（2005·江苏生物·11）能够使植物体表达动物蛋白的育种方法是（）

A、单倍体育种

B、杂交育种

C、基因工程育种

D、多倍体育种C9。(高考试题：2007广东生物)7.现有一长度为1000碱基对(by）的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoR1酶切后得到的DNA分子仍是1000by，用Kpn1单独酶切得到400by和600by两种长度的DNA分子，用EcoRI,Kpnl同时酶切后得到200by和600by两种长度的DNA分子。该DNA分子的酶切图谱正确的是【答案】D10、采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导人目的基因的作法正确的是（）①将毒素蛋白注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导人细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养④将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A．①②B．②③C．③④D．④①C11、番茄在运输和贮藏过程中，由于过早成熟而易腐烂，应用基因工程技术，通过抑制某种促进果实成熟激素的合成能力，可使番茄贮藏时间延长，培育成耐贮藏的番茄新品种，这种转基因番茄已于1953年在美国上市，请回答：(1)在培育转基因番茄的基因操作中，所用的基因的“剪刀”是

，基因的“针线”是

,基因的“运输工具”是

(2)与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是

限制酶DNA连接酶运载体目的性强，育种周期短；克服远缘杂交不亲和的障碍1