流式细胞术原理及临床应用-文档

流式细胞术的原理及临床应用

流式细胞术(flowcytometryFCM)是利用流式细胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的分析技术。流式细胞术的概念流式细胞术特点快速检测流动的单细胞或颗粒，达上万个/每秒检测物可以是细胞、细菌或各种微粒，0.5-50mm范围内

多参数同时分析，FS/SS/FLs(荧光)

可分析，可分选特点

FCM的工作原理

流式细胞仪组成：1.液流系统：样本被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的抗体染色后置入样品管中，在气体压力下使其形成单细胞液柱。2.光学系统：由激发光源、分光镜、光束成形器等组成。

散射光信号：

前向散射光（FS）：在激光束正前方，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，反映细胞颗粒的大小。

侧向散射光（sidescatter，SS）：与激光束垂直方向，主要用于检测细胞内部结构属性，反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程度。荧光信号：每种荧光染料都有特定的激发波长，受激光激发后会产生特定波长的荧光和颜色。流式细胞仪利用不同波长的光学滤片来检测这些特定发射波长的光学信号。荧光信号反映被染上荧光的细胞数量多少。

FCM的工作原理

流式细胞仪组成：3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成。通过检测散射光及荧光信号对实验数据进行分析、存储、显示。可用流式细胞仪分析的标本

外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、各种体液（尿、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等）

必需制备成单细胞悬液单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细胞粒子、可溶性分子

流式细胞仪的基本功能细胞表型分析：包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析DNA含量及细胞周期分析、细胞凋亡检测目标细胞分选自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测流式蛋白定量技术：血浆中各种细胞因子的含量

临床免疫学临床血液学临床肿瘤学血栓与止血骨髓和器官移植基础医学研究流式细胞术的临床应用（一）FCM在临床免疫学中的应用机体免疫状态是衡量机体是否罹患疾病的重要指标，采用流式细胞术来检测淋巴细胞亚群，评估机体的免疫状态。T淋巴细胞进一步细分：

CD4+:Th1:介导细胞免疫、参与自身免疫性疾病与炎症反应。Th2:介导体液免疫，参与过敏反应和体液免疫性疾病CD8+：

细胞毒性TCD8+CD28+：释放细胞毒素，杀死靶细胞抑制性T淋巴细胞CD8+CD28-:抑制某些淋巴细胞的活性淋巴细胞细胞亚群临床意义;测定人类淋巴细胞亚群的变化，对早期发现和控制疾病，指导临床治疗，评估机体免疫状态有着非常重要意义。

自身免疫性疾病：

SLE

CD4+细胞、CD4/CD8比值↓，CD8+细胞↑

免疫缺陷性疾病：

AIDSCD4+细胞、CD4/CD8比值↓

感染性疾病：病毒、细菌、寄生虫感染肿瘤免疫监测：放疗和化疗可引起免疫抑制，免疫功能恢复慢提示预后较差，免疫恢复较快者，预后较好移植免疫监测：CD3+持续增加提示已开始发生排异，CD4+/CD8+T持续下降，表明有感染发生，当其比值小于0.2时必需停用免疫抑制剂。HLA-B27:强直性脊柱炎外周血淋巴细胞HLA-B27的表达及其表达程度与强直性脊柱炎的发生有很大相关性，利用流式细胞术进行HLA-B27检测，可同时排除交叉反应，是目前检测HLA-B27的最好方法。(二)FCM在临床血液学中的应用1.白血病的MIC分型

Morphology（形态学）

Immunology（免疫学）

Cytogenetics（细胞遗传学）白血病免疫分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。免疫分型的临床意义

弥补FAB分型的不足

诊断其他血液系统肿瘤

诊断仅表达个别非本系列相关抗原的急性白血病（LY+—AML、MY+—ALL）

急性双系或双表型白血病的诊断

骨髓增生异常综合征（MDS）免疫表型分析的临床意义

免疫分型对鉴别慢性淋巴细胞增生性疾病各亚型亦有肯定的诊断价值以下为各系列较特别的标志：

AML：

MPO、CD33、CDl3、CDl4CDl5、CDllb、CDllc

T-ALL：

c／mCD3、CD2、CD5、CD7、CD4／CD8、CD38

B-ALL：

cCD22、cCD79、CDl9、CDl0、CD24、HLA—DR、CD20、

CD38

造血干／祖细胞:CD34、CDll7、CD38、HLA-DR、ACl33造血干细胞计数：造血干细胞移植判断采集的时机和数量：利用流式细胞仪可对造血干细胞动员过程中，外周血的造血干细胞（CD34）含量进行计数，判断采集的时机和数量。移植后的患者进行监控：当患者CD3+、CD25+持续增加提示已开始发生排异，CD4+/CD8+

T持续下降，表明有感染发生，当其比值小于0.2时必需停用免疫抑制剂。

FCM检测白血病微小残留病变(MRD):

MRD是白血病复发的主要根源，FCM的高特异性和敏感性可以在患者缓解期检测是否有残留病变细胞，早期探测MRD，以免复发

FCM在临床肿瘤学中的应用1.血液标本的检查肿瘤患者的免疫功能检查肿瘤患者的粘附分子检查：在肿瘤的浸润与转移过程中发挥重要作用。ICAM-1CD54ICAM-2CD102ICAM-3CD1062.肿瘤实体标本的FCM检查细胞DNA分析肿瘤细胞耐药性细胞凋亡检查肿瘤相关抗原激素受体与癌细胞生物行为有关的因子，如CD44

利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱基结合，被这些荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量。细胞DNA分析原理细胞周期与DNA的倍体关系DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指标:良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；实体恶性肿瘤的非2倍体出现率>70%如果交界性肿瘤出现异倍体即已具有恶性特征,尽管病理形态学尚不能证实,也应视为恶性。ＤＮＡ倍体检测转移性癌良性反应性增生早期诊断

FCM通过精确定量DNA含量，能对癌前病变的性质和发展趋势作出判断，有助于癌前病变的早期诊断为治疗方案和药理学研究提供依据：可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。判断预后DNA异倍体、高S期细胞比值和高增殖细胞核抗原（PCNA）表达与细胞增殖能力、恶性程度和不良预后呈正相关。细胞DNA分析临床意义

肿瘤细胞耐药性

MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（P-gp）亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对化疗药物开始出现耐药性，需要考虑其他治疗方式

细胞死亡分两种：凋亡和坏死细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应

凋亡的检测细胞凋亡的生物学意义

胚胎形成、肌体正常发育、衰老和损伤细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归等都与细胞凋亡有关。生物医学的研究热点FCM在血栓性疾与止血中应用

由于活化血小板是血栓的主要