病毒感染检查方法和防治原则专家讲座

第24章病毒感染检验方法与防治标准中南大学基础医学院微生物学系讲授戴橄病毒感染检查方法和防治原则第1页内容第一节病毒感染检验方法第二节病毒感染特异性预防(自学)第三节病毒感染治疗(自学)病毒感染检查方法和防治原则第2页第一节病毒感染诊疗（Diagnosisofviralinfection）◙标本采集与送检标准◙病毒感染检验方法病毒感染检查方法和防治原则第3页一、标本采集与送检标准◙按疾病种类与病程采取不一样标本◙在发病早期与用药之前采取标本◙无菌操作，有菌标本用“双抗”（青、链霉素）或“三抗”（青、链霉素+两性霉素B）处理◙

冷藏速送，病变组织用50％甘油保留◙血清学检测：IgM—

单份血清

IgG—

双份血清病毒感染检查方法和防治原则第4页二、检验方法◙病毒形态学检验◙病毒血清学检验◙病毒分子生物学检验◙病毒分离培养与判定快速诊疗病毒感染检查方法和防治原则第5页病毒分离培养与判定:◙

病毒分离培养◙

病毒判定◙

病毒数量及感染性测定病毒感染检查方法和防治原则第6页病毒分离培养方法：

动物接种

鸡胚培养

细胞培养:病毒感染检查方法和防治原则第7页⑴

动物接种(animalinoculation)动物：鼠、兔、猴、黑猩猩等优点：结果易观察，可建立动物模型缺点：有喂养条件要求，费用高、动物体内常带有潜伏病毒。当前已极少应用。病毒感染检查方法和防治原则第8页⑵

鸡胚培养(embryonatedeggculture)受精卵孵育9-14天鸡胚接种病毒孵育2-7天收获对应材料进行判定病毒感染检查方法和防治原则第9页鸡胚接种部位：尿囊腔接种绒毛尿囊膜接种卵黄囊接种羊膜腔接种病毒感染检查方法和防治原则第10页(3)细胞培养(cellculture)依据细胞生长方式分:

单层细胞培养（monolayercellculture）

悬浮细胞培养（suspendedcellculture）病毒感染检查方法和防治原则第11页依据细胞起源、染色体特征及传代次数分:

原代培养细胞

二倍体细胞株

传代细胞系或株(3)细胞培养(cellculture)病毒感染检查方法和防治原则第12页①原代培养细胞（primaryculturalcells)动物组织单层细胞(原代细胞)

剪碎组织块蛋白酶分散成单个细胞培养基传代培养单层细胞(次代细胞)原代培养：将动物组织消化后在体外首次培养。

病毒感染检查方法和防治原则第13页①原代培养细胞（primaryculturalcells)特点:◙对各种病毒敏感◙生长能力有限,获取成本高◙可携带潜伏病毒应用:◙病毒分离与判定◙病毒学试验研究◙不能用于制备疫苗epithelialcells病毒感染检查方法和防治原则第14页体外分裂50~100代仍保持二倍染色体数目标单层细胞特点:◙对各种病毒敏感◙不带异种蛋白(人源性)◙

不带病毒,无致瘤潜能应用:◙病毒分离与判定◙病毒学试验研究◙

制备疫苗②二倍体细胞株(diploidcellstrain)fibroblasticcells病毒感染检查方法和防治原则第15页③传代细胞系(continuouscellline)特点:◙对各种病毒敏感性高◙繁殖能力强,传代时间长◙有致癌危险(起源于癌细胞或突变二倍体细胞株)应用:◙病毒分离与判定◙病毒学试验研究◙不能用于制备疫苗能在体外无限传代细胞系。如HeLa,Hep-2epithelioidcells病毒感染检查方法和防治原则第16页:◙

病毒分离培养◙

病毒判定◙

病毒数量及感染性测定病毒分离培养与判定病毒感染检查方法和防治原则第17页病毒判定：

病毒在细胞中增殖指标

病毒形态学判定

病毒抗原判定

病毒基因判定病毒感染检查方法和防治原则第18页⑴

细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)

病毒在敏感细胞内增殖引发光镜下可见细胞病理改变。

病毒感染检查方法和防治原则第19页①CPE：病毒感染细胞发生形态改变病毒感染检查方法和防治原则第20页SyncytiumformationincellculturecausedbyRSV(top),andmeaslesvirus(bottom).

②CPE：病毒感染细胞与邻近细胞融合病毒感染检查方法和防治原则第21页③CPE：形成包涵体（inclusionbody）(核内)(胞浆内)病毒感染检查方法和防治原则第22页Syncytialformationcausedbymumpsvirusandhaemadsorptionoferythrocytesontothesurfaceofthecellsheet.⑵

红细胞吸附（hemadsorption,HAd）受染细胞膜表面血凝素（HA）＋RBC表面HA受体病毒感染检查方法和防治原则第23页⑶干扰现象（interference）风疹病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE（－）埃可病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE（＋）＋人胚肾细胞风疹病毒？埃可病毒CPE(-)——埃可病毒(-)

风疹病毒(+)CPE(+)——埃可病毒(+)

风疹病毒(-)病毒感染检查方法和防治原则第24页⑷

细胞代谢改变病毒感染细胞在细胞内增值细胞代谢改变培养液pH值改变病毒感染检查方法和防治原则第25页:◙

病毒分离培养◙

病毒判定◙

病毒数量与感染性测定病毒分离培养与判定病毒感染检查方法和防治原则第26页

病毒数量与感染性测定：蚀(空)斑形成试验50%组织细胞感染量病毒总量(活病毒+死病毒)：感染性病毒量:血凝试验病毒感染检查方法和防治原则第27页蚀(空)斑形成试验（plaqueassay）

原理：将适当稀释浓度病毒液定量接种于敏感单层细胞，经一段时间吸附后，在细胞上覆盖一层未凝固琼脂，待其凝固后继续培养，因为病毒增值使感染单层细胞病变脱落，形成肉眼可见空斑，一个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒增殖而形成，计数平板中空斑数可计算出样品中活病毒数量。

通常以每毫升病毒液空斑形成单位（plaqueformingunit,PFU),既PFU/ml表示。病毒感染检查方法和防治原则第28页PLAQUEASSAYPLAQUEASSAY病毒感染检查方法和防治原则第29页PLAQUEASSAYPLAQUEASSAY病毒感染检查方法和防治原则第30页PLAQUEASSAYPLAQUEASSAY病毒感染检查方法和防治原则第31页蚀(空)斑形成试验（plaqueassay）

Verocells,whichgrewconfluentlyonthebottomoftheplasticplate(1.5cmdiameter),wereinfectedwithherpessimplexvirus

病毒感染检查方法和防治原则第32页用途：◙测定感染性病毒量

单位:PFU(plaqueformingunit)/ml

由一个感染性病毒颗粒增殖而形成一个空斑称为空斑形成单位。◙分纯病毒蚀(空)斑形成试验（plaqueassay）

病毒感染检查方法和防治原则第33页50%组织细胞感染量

(50%tissuecultureinfectiousdose,TCID50)概念：测定病毒感染细胞后引发50%细胞病变或死亡最小病毒量。方法：将待测病毒液作10倍系列稀释，分别接种于单层细胞，经培养后观察CPE等指标，以能使50%细胞感染病毒最高稀释度作为终点。用统计方法计算出50%组织细胞感染量。用途：判断病毒感染性和毒力病毒感染检查方法和防治原则第34页50%组织细胞感染量(TCID50)病毒感染检查方法和防治原则第35页1.名词解释:cytopathiceffect（CPE）