临床PCR试剂盒的选用和质检专家讲座

临床PCR试剂盒选取和质检卫生部临床检验中心李金明临床PCR试剂盒的选用和质检第1页PCR或RT-PCR试剂盒组成核酸提取试剂核酸扩增或逆转录-核酸扩增试剂产物检测试剂（有些使用全自动分析仪PCR方法因其核酸扩增和检测同时完成，故无专门产物检测试剂）临床PCR试剂盒的选用和质检第2页影响PCR试剂盒质量原因内在原因:原材料、核酸提取方法、方法学设计临床PCR试剂盒的选用和质检第3页影响PCR试剂盒质量原因：

扩增所需原材料寡核苷酸引物和探针缓冲液和dNTP聚合酶、逆转录酶等临床PCR试剂盒的选用和质检第4页PCR反应混合物

Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶rTthDNA多聚酶AmpErase

生物素标记引物和或和临床PCR试剂盒的选用和质检第5页寡核苷酸引物和探针其对试剂盒质量影响首先是纯度。纯度判断可依据260/280吸光度比值来判断，如‹2.0，则需重新纯化。另一个方法是将其在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，如出现一条以上带或迁移位置错误，则需重新纯化。是否有污染。结合特异性（浓度）临床PCR试剂盒的选用和质检第6页dNTP和缓冲液dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP）浓度缓冲液：在储存和扩增循环中稳定、作为聚合酶活性所必须Mg＋＋（或用于rTthMn＋＋）浓度以及pH等临床PCR试剂盒的选用和质检第7页逆转录酶、DNA聚合酶酶浓度酶活性临床PCR试剂盒的选用和质检第8页核酸扩增方法PCRRT－PCR转录依赖扩增（TMA）连接酶链反应（LCR）链替换扩增（SDA）等临床PCR试剂盒的选用和质检第9页影响PCR试剂盒质量原因：

核酸提取核酸提取有效性核酸提取简便性临床PCR试剂盒的选用和质检第10页临床PCR试剂盒的选用和质检第11页临床PCR试剂盒的选用和质检第12页临床PCR试剂盒的选用和质检第13页影响PCR试剂盒质量原因：产物检测杂交固相特异探针及其标识物临床PCR试剂盒的选用和质检第14页临床PCR试剂盒的选用和质检第15页临床PCR试剂盒的选用和质检第16页影响PCR试剂盒质量原因内在原因:原材料、核酸提取方法、方法学设计外在原因：试剂盒运输和贮存外在原因：试剂盒运输和贮存临床PCR试剂盒的选用和质检第17页试剂盒运输和贮存PCR试剂盒使用期普通为6个月，这是指在适当贮存温度下。核酸扩增部分试剂普通要贮存于-20℃下；产物检测部分试剂则贮存于2～8℃。试剂盒从厂家到用户手中，均要经历运输及运输中贮存，任一步骤不妥，均会影响试剂盒临床使用质量。临床PCR试剂盒的选用和质检第18页PCR试剂盒分类定性测定：PCR-ELISA、PCR-膜上杂交（杂交梳）、荧光PCR（分子信标和TaqMan等）定量测定：PCR-ELISA、TaqMan和Amplisensor荧光定量、AmplicorPCR-ELISA定量等。临床PCR试剂盒的选用和质检第19页PCR试剂盒选取标准参考试剂生产厂家信息广告参考同行对相关试剂盒使用效果参考相关机构综合评价依据使用目标依据所在试验室技术特点依据所在医院患者承受能力临床PCR试剂盒的选用和质检第20页PCR试剂盒质检外包装：厂家名称、检测目标、同意文号、批号和使用期等。内包装：试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损以、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。临床PCR试剂盒的选用和质检第21页PCR试剂盒质检(定性测定)性能质检采取血清（样本）盘（Panel）质检：PCR试剂血清（样本）盘由一定数量原血清阴、阳性样本、2～3份纯化核酸（DNA或RNA或cDNA）样本以及3～5份系列稀释阳性样本所组成。样本总数可定在20份左右。原血清样本用于判断试剂盒对特定病原体核酸检出特异性、灵敏度和符合率；纯化核酸样本用于判断DNA扩增或逆转录及DNA扩增有效性；系列稀释阳性样本用于判断试剂测定下限。临床PCR试剂盒的选用和质检第22页试剂特异性、灵敏度和符合率计算公式临床PCR试剂盒的选用和质检第23页试剂特异性、灵敏度和符合率计算公式灵敏度（％）＝(a/a+c)100%特异性（％）＝(d/b+d)100%符合率（％）＝(a+d/a+b+c+d)100%临床PCR试剂盒的选用和质检第24页PCR试剂盒质检(定量测定)样本：已知浓度高、中、低三种浓度质控物。质检内容：测定重复性测定范围抗干扰能力临床PCR试剂盒的选用和质检第25页技术验收依据：《临床检验扩增检验试验室管理暂行方法》卫医发[]10号《临床基因扩增检验试验室工作规范》卫检字第8号临床PCR试剂盒的选用和质检第26页技术验收内容试验室设置和设备设施和环境人员设备管理检测方法标本管理统计汇报质量控制埋怨等十章共三十八条临床PCR试剂盒的选用和质检第27页试验室设置和设备本章共七条。试验室分区：规范化分区、明确识别标识防污染：空气流向、中央空调、各区间封闭性各区仪器设备物品配置：充分性、科学性、专用性（标识）

“生物安全柜”“可移动紫外灯”“加样器”临床PCR试剂盒的选用和质检第28页设施和环境本章包含五条；试验室设施、工作区域、能源、照明等；环境和试验条件控制设施：温湿度计、不间断或稳压电源等；试验室进出限制和控制：人员进入控制标识、生物传染危险性标识试验室“内务管理”（如人员流动、清洁等）制度和对应设施；废弃血清处理、生物防护等办法和对应设施临床PCR试剂盒的选用和质检第29页设施和环境需注意问题清洁程序或制度

清洁用具专用、清洁工作单一流向、清洁方法详细性生物防护及废弃血清处理对工作人员保护和对环境保护

锐器使用规则生物传染危险性废弃物出试验室前预处理临床PCR试剂盒的选用和质检第30页人员本章包含三条。人员数量足够；有培训上岗证培训计划：室内定时培训（统计）人员技术（资格、培训、技能）档案。临床PCR试剂盒的选用和质检第31页设备管理（1）本章包含三条。主要仪器设备应得到正确维护，应有设备维护程序文件；以及维护统计加样器、温度计、扩增仪和酶标仪等设备应有校准程序文件、有显著标识表明其校准状态（此次校按时间及下次应校按时间）；试验室应保留每一台仪器设备档案材料，对档案材料详细内容作了详细要求。临床PCR试剂盒的选用和质检第32页设备和质控物（2）每一台设备档案内容包含：（a）设备名称；（b）制造商名称、型号、序号等；（c）接收日期和启用日期；（d）当前放置地点；（e）接收时状态；（f）仪器使用说明书有复印件；（g）校准和/或检定日期和结果及下次校准和/或检定日期；（h）迄今所进行维护和今后维护计划细节；（i）损坏、故障、改装或修理历史。临床PCR试剂盒的选用和质检第33页检测方法本章包含三条。标准操作程序（SOP）：仪器设备操作和校准程序；标本搜集处理程序；扩增检测工作程序；仪器试剂选购和质检程序；消耗性材料购置、验收、质检和贮存程序。SOP应现行有效及便于使用。临床PCR试剂盒的选用和质检第34页标本管理本章包含五条。建立唯一编号识别系统，防止标本混同；标本采集、运输和保留程序；标本接收时状态统计；标本适用性和充分性；标本贮存标准操作程序及贮存温度控制办法;标本接收及安全处置程序；维护试验室老实性必要办法。临床PCR试剂盒的选用和质检第35页记录本章包含三条。有统计管理制度：适合本身实际情况，符合现行规章制度；（由谁管、在何处管、保留多长时间）原始统计、计算和导出数据应归档并保留；统计应有相关人员签字；全部统计和汇报都要妥善保管并保密。临床PCR试剂盒的选用和质检第36页报告检测结果汇报应准确、清楚和客观；定性测定汇报“阴性”或“阳性”；定量测定则以拷贝数/ml或IU/ml汇报；防止二者之间混同；每份汇报应包含以下信息：标题、唯一标识、检测标本说明、标本特征和状态、标本接收日期和检测日期、检测方法、检测和校核人员签字及发出日期、参考结果或范围；如对汇报有效性有疑问，试验室应马上通知临床相关科室给予更正程序；有汇报发放程序：用电话、传真、电子邮件汇报结果时保密标准。临床PCR试剂盒的选用和质检第37页质量控制试验室应有室内质量控制标准操作程序

质控物起源、浓度、批号阴性质控设置所选择统计质控方法（均值、SD怎样得到）失控判断标准失控以后怎么办试验室应参加室间质量评价。临床PCR试剂盒的选用和质检第38页抱怨试验室应制订埋怨及其处理SOP；

可操作性、不一样埋怨处理如埋怨包括到工