分子生物学基因工程和核酸杂交专家讲座

医学分子生物学

钟连进

检验医学院/生命科学学院1分子生物学基因工程和核酸杂交第1页4基因工程基因工程（DNArecombination）：又称DNA重组技术（geneengineering），是指将外源基因经过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表示技术。分子克隆（molecularcloning）：是指将目标DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以取得该DNA分子大量拷贝技术。2分子生物学基因工程和核酸杂交第2页4.1工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶DNA连接酶碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶核酸酶S13分子生物学基因工程和核酸杂交第3页1、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）：简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列核酸水解酶。4分子生物学基因工程和核酸杂交第4页第一个字母取自产生该酶细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发觉先后次序。HindⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株第三种酶限制性核酸内切酶命名5分子生物学基因工程和核酸杂交第5页作用ⅠⅡⅢ三种限制性核酸内切酶作用酶活性

核酸内切酶

核酸内切酶

核酸内切酶

甲基化酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶DNA链上无

有

有特异识别位点DNA链上无

在识别序列内

在识别序列外特异切割位点在分子克隆中无

有

无主要意义6分子生物学基因工程和核酸杂交第6页限制酶能识别双链DNA特异4

8个碱基对，并在此序列内特异切割DNA。限制酶功效：依据需要在特定位点上准确切割双链DNA分子。回文结构（palindromestructure）：指双链DNA分子上按对称轴排列反向互补序列（常为限制酶所识别）。限制性核酸内切酶作用7分子生物学基因工程和核酸杂交第7页5

——GAATTC——3

ATATGC5’3’EcoRⅠ识别序列：对称轴3

——CTTAAG——5

8分子生物学基因工程和核酸杂交第8页粘性末端（stickyend）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生末端。平末端（bluntend）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生末端。—GAATTC——CTTAAG—EcoRⅠ—CCCGGG——GGGCCC—SmaⅠ9分子生物学基因工程和核酸杂交第9页10分子生物学基因工程和核酸杂交第10页11分子生物学基因工程和核酸杂交第11页12分子生物学基因工程和核酸杂交第12页同工异源酶（isoschizomers）：指起源不一样，但能识别和切割同一位点酶。

同尾酶（isocaudarner）：指识别序列不一样，但能产生相同粘性末端酶。如：BamHⅠ和BstⅠ（GGATCC）

XhoⅠ和

PaeR7（CTCGAG）如：BamHⅠ（G

GATC

C）Sau3AⅠ（N

GATC

N）。由此产生DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时含有更大灵活性。13分子生物学基因工程和核酸杂交第13页1）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ）是单一多肽链多功效酶，分子量为103kD，它含有3种酶活性：①5

→3

DNA聚合酶活性②3

→5

核酸外切酶活性③5

→3

核酸外切酶活性2、DNA聚合酶14分子生物学基因工程和核酸杂交第14页5

→3

外切酶5

→3

聚合酶3

→5

外切酶(103kD)Klenow片段NC5

→3

聚合酶3

→5

外切酶(68kD)35kD(小)68kD(大)N枯草杆菌蛋白酶DNA聚合酶Ⅰ15分子生物学基因工程和核酸杂交第15页补齐双链DNA3

末端，同时可使3

末端DNA标识上同位素。cDNA克隆中，合成cDNA第二链。DNA序列分析。Klenow片段主要用途16分子生物学基因工程和核酸杂交第16页TaqDNA聚合酶（简称Taq酶）是一个耐热DNA聚合酶，分子量为65Kd，最正确作用温度是70~80℃，Taq酶含有5

→3

聚合酶活性和依赖于聚合作用5

→3

外切酶活性。TaqDNA聚合酶可用于DNA测序及经过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子特定序列进行体外扩增。

2）TaqDNA聚合酶17分子生物学基因工程和核酸杂交第17页逆转录酶（reversetranscriptase）是依赖RNADNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功效酶。①RNA指导DNA聚合酶活性（RDDP）②核糖核酸酶H活性（RNaseH）③DNA聚合酶活性（DDDP）3）逆转录酶18分子生物学基因工程和核酸杂交第18页5

3

3

5

RNA(用表示)RNA-DNA

杂化分子3

5

RNase（核酸酶H活性)

DDDP（DNA聚合酶活性）

4种dNTP

RDDP（逆转录酶）引物、4种dNTP病毒双链DNA用

表示）（cDNA第二链(complementaryDNA，cDNA

)与病毒RNA互补DNA(用表示)5

3

3

5

5

3

5

3

19分子生物学基因工程和核酸杂交第19页末端脱氧核苷酰转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，简称末端转移酶）：分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子3

末端-OH上。末端转移酶功效主要有：

在载体或目标基因3

末端加上互补同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。用于DNA3

末端同位素探针标识。4）末端脱氧核苷酰转移酶20分子生物学基因工程和核酸杂交第20页(A、G、C、T)nOH5′3′5′3′OH5′3′5′3′(A、G、C、T)nMg2+dNTPnppiMg2+dNTPnppi5′3′OH5′3′OH

5′3′5′3′(A、G、C、T)nCo2+dNTPnppiCo2+dNTPnppi（1）底物是单链DNA或有3

突出末端双链DNA，需要Mg2+。（2）底物是平端或3

凹端双链DNA，需要Co2+。(A、G、C、T)n21分子生物学基因工程和核酸杂交第21页DNA连接酶（DNAligase）：称为基因工程缝纫针，它主要功效是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子5

磷酸基团与3

羟基形成磷酸二酯键，将含有相同粘性末端或平末端DNA连接起来。DNA连接酶包含大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两种类型。3、DNA连接酶22分子生物学基因工程和核酸杂交第22页23分子生物学基因工程和核酸杂交第23页碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上5

-磷酸基团。主要用途有：除去DNA片段上5

磷酸以防本身连接。在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标识前，从RNA或DNA上除去5端磷酸。4、碱性磷酸酶

5

-pCpGpC┅┅-OH3

碱性磷酸酶5

-CpGpC┅┅-OH3

5

-p3

-HO5

-HO3

-HO24分子生物学基因工程和核酸杂交第24页5、T4多核苷酸激酶5’-

CpGpC┅┅-OH3’p+ADP+ATP5’-CpGpC┅┅-OH3’T4多核苷酸激酶①前向反应：②交换反应：5’-CpGpC┅┅-OH3’+ADP[

-32P]dATP二硫苏糖醇,Mg2+过量ADPT4多核苷酸激酶p*

+ATP25分子生物学基因工程和核酸杂交第25页核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中单链部分。其主要作用有：除去粘性末端以产生平末端。除去cDNA合成时形成发夹结构。分析RNA茎环结构和DNA-RNA分子杂交情况。6、核酸酶S1核酸酶S1核酸酶S1核酸酶S1+26分子生物学基因工程和核酸杂交第26页4.2载体载体（vector）：指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表示工具。载体本质为DNA。制备目标基因或DNA片段必须与适当载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表示。惯用载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。27分子生物学基因工程和核酸杂交第27页1、克隆载体克隆载体：能将载体外源DNA在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目标DNA载体。28分子生物学基因工程和核酸杂交第28页能自我复制并具较高拷贝数。分子量普通<10Kb。带有遗传筛选标识。有适当限制酶酶切位点，便于外源DNA插入和筛选。多克隆位点（multiplecloningsites，MCS）：载体上含有多个限制酶单一酶切位点。克隆载体应具备特征29分子生物学基因工程和核酸杂交第29页1）质粒克隆载体质粒克隆载体主要用途：

①用于保留和扩增<2Kb目标DNA。②构建cDNA文库。③目标DNA测序。④作为核酸杂交时探针起源。30分子生物学基因工程和核酸杂交第30页pBR322质粒克隆载体pBR322质粒是由一系列大肠杆菌质粒DNA经过DNA重组技术构建而成双链克隆载体，长为4.36Kb。它含有一个能确保高拷贝自我复制复制起始点（Ori），并装有四环素抗性（Tetr）基因和氨苄青霉素抗性（Ampr）基因供菌落筛选。在这两个抗性基因中分别含有BamHI和PstI等限制酶单一酶切位点，用于插入外源DNA片段。如有外源基因插入，会造成这些标志性基因失活。31分子生物学基因工程和核酸杂交第31页复制起始点抗药基因抗药基因pBR322载体32分子生物学基因工程和核酸杂交第32页pUC系列载体pUC系列载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成双链DNA质粒载体。pUC18和pUC19质粒长约2.69Kb，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。pUC质粒含Ampr，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子lacZ

基因，该基因序列中含有多克隆位点。33分子生物学基因工程和核酸杂交第33页pUC18载体34分子生物学基因工程和核酸杂交第34页2）噬菌体克隆载体噬菌体（bacteriophage，phage）：指感染细菌病毒。按其生活周期分为两种类型：溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放噬菌体又可感染其它细菌。溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将本身DNA整合到细菌染色体中，和细菌染色体一起复制。35分子生物学基因工程和核酸杂交第35页野生型

噬菌体是线性双链DNA，全长约48.5Kb，其中60%（约30Kb）是溶菌生长所必需，中间40%区域为非必需，可被外源DNA片段代替而不影响

噬菌体生存。

噬菌体5

末端含12核苷酸互补单链次序，是天然粘性末端，称为cos位点，

噬菌体感染宿主菌后，其粘端经过碱基配对而结合，形成环状DNA分子。

噬菌体载体36分子生物学基因工程和核酸杂交第36页

噬菌体载体结构

37分子生物学基因工程和核酸杂交第37页

噬菌体载体特点重组噬菌体分子量必须在野生型噬菌体75%~105%之间。筛选标识：外源基因插入型：蓝白斑(LacZ)筛选。外源基因置换型：噬菌斑数目（转染率高100~1000倍）。38分子生物学基因工程和核酸杂交第38页

噬菌体载体用途①用作普通克隆载体。②用于构建基因组或cDNA文库（<22Kb）。③用于抗体库或随机肽库构建。④核酸序列分析。39分子生物学基因工程和核酸杂交第39页M13噬菌体野生型M13噬菌体为6.4Kb左右闭环正链DNA分子。克隆外源基因片段<1kb。M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，可用于感染(经包装单链DNA)和转化(双链DNA)。M13中引入多克隆位点，恰好插入LacZ基因内，可利用蓝白色噬菌斑筛选重组体。M13噬菌体只降低宿主细胞生长速度，而不溶解宿主细胞（呈溶源状态生长，故可从细菌培养液中取得噬菌体，制备单链DNA）。40分子生物学基因工程和核酸杂交第40页M13噬菌体在细菌内复制模式图噬菌体正链复制复制型DNA经pII蛋白造缺口3′5′5′3′3′5′滚环复制释出单链DNA(正链)经pII蛋白剪切进入下一循环41分子生物学基因工程和核酸杂交第41页粘粒(cosmid)是由质粒和

噬菌体cos位点构建而成。粘粒载体组成：质粒复制起始位点(Ori)。携带抗药基因。用于插入目标基因单一酶切位点。

噬菌体cos位点。3）粘粒克隆载体42分子生物学基因工程和核酸杂交第42页粘粒载体特点粘粒载体大小为4～6Kb，而插入外源基因长达40～50kb。加入

噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于

噬菌体具感染能力颗粒，轻易进入大肠杆菌。粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体功效，而表现质粒特征。43分子生物学基因工程和核酸杂交第43页粘粒载体用途①克隆大片段DNA。②构建基因组文库。44分子生物学基因工程和核酸杂交第44页2、表示载体表示载体是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译载体。基因表示、合成有功效蛋白质依赖于基因有效转录、mRNA正确翻译和翻译后加工。45分子生物学基因工程和核酸杂交第45页汇报基因（reportergene）为了判断某一待测DNA序列生物活性，常采取汇报基因方法。汇报基因：是指处于待测基因下游并经过转录和表示水平来反应上游待测基因功效基因，又称报道基因。46分子生物学基因工程和核酸杂交第46页1）原核细胞表示载体真核基因在原核细胞中表示需要确保外源基因：插入方向正确性；受原核开启子控制；必须能在原核细胞中有效转录和有效翻译。外源基因在原核细胞中表示需要主要调控元件。47分子生物学基因工程和核酸杂交第47页原核细胞表示载体主要是大肠杆菌表示载体。大肠杆菌表示载体是在克隆载体基础上导入表示系统调控元件：开启子—核糖体结合位点—转录终止信号。48分子生物学基因工程和核酸杂交第48页（1）开启子（promoter）如乳糖开启子（Lac）、色氨酸开启子（Trp）、Tac开启子（Trp-Lac）以及PL和PR开启子等。5

—TTGACA——TATAAT———//——3

-35区-10区转录起始点PribnowboxDNA原核细胞开启子示意图49分子生物学基因工程和核酸杂交第49页（2）SD序列mRNA50分子生物学基因工程和核酸杂交第50页（3）终止子（terminator）终止子：一个基因3

末端有一特定DNA序列，它含有被RNA聚合酶识别并停顿转录功效。该序列含有一段富含A/T和富含G/C回文对称结构，终止子转录后形成RNA含有茎环状局部二级结构。51分子生物学基因工程和核酸杂交第51页-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCTTTTTTNNN-DNA-NNTTCGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN-G/C富含区2G/C富含区1A/T富含区5

3

5

3

RNA-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH5

3

RNA结构5

GC

NNNNCCGCGCGGCGCAUAU—NNNNUUUU-OH

3

DNA转录强终止子模式图转录52分子生物学基因工程和核酸杂交第52页非融合型表示载体：产生外源蛋白，易被原核细胞蛋白酶降解。如pKK223-3质粒载体。分泌型表示载体：产生带信号肽分泌型融合蛋白，可降低外源蛋白被降解以及使蛋白质能在细胞外正确折叠，易提取。如PINlll系列。融合型表示载体：产生由较短原核细胞多肽和真核细胞蛋白质组成融合蛋白，含有抗原性，较天然外源蛋白稳定。如pGEX系列。原核细胞表示载体类型53分子生物学基因工程和核酸杂交第53页真核表示载体真核表示元件有：开启子/增强子—终止位点和加polyA信号。原核质粒序列：包含复制起始序列和抗药基因标识。开启子：转录起始位点上游25~30bp有富含ATTATA框，TATA框上游约100~200bp处为上游开启子元件。增强子（enhancer）：是一类显著提升基因转录效率顺式作用元件。终止子和加polyA信号（AAUAA）。2）哺乳动物细胞表示载体54分子生物学基因工程和核酸杂交第54页目标基因获取载体选择目标基因和载体连接重组DNA导入受体细胞重组体筛选和判定4.3基因工程基本步骤55分子生物学基因工程和核酸杂交第55页连接含重组子阳性克隆载体+目标基因转化、筛选和判定阳性克隆DNA重组体+受体细胞基因工程基本步骤——分、切、接、转、筛56分子生物学基因工程和核酸杂交第56页

1）从基因文库中获取2）逆转录合成cDNA3）人工合成DNA片段4）直接从染色体DNA中分离目标基因1、目标基因获取57分子生物学基因工程和核酸杂交第57页1）从基因文库中获取目标基因：指被研究某一基因或DNA序列，即需要克隆或表示基因。基因组文库（genomiclibrary，G-文库）是指含有某种生物全部基因随机片段重组DNA克隆群。58分子生物学基因工程和核酸杂交第58页用逆转录法得到目标基因进行克隆，可取得较完整连续编码序列，易在宿主细胞中表示及筛选。选取富含目标基因mRNA细胞作为试验材料，有利于分离到目标基因。如胰岛素基因mRNA主要存在于胰腺组织，血红蛋白基因mRNA占网质红细胞总mRNA50%~90%。2）逆转录合成cDNA59分子生物学基因工程和核酸杂交第59页依据已知基因核苷酸序列或基因产物氨基酸序列，可推导出为该多肽编码核苷酸短序列，再用DNA合成仪人工合成目标基因。适合用于合成分子量较小目标基因（100bp以内）。如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原基因等。3）人工合成DNA片段60分子生物学基因工程和核酸杂交第60页依据染色体DNA限制性内切酶图谱，用适当限制性内切酶切割染色体DNA、分离目标基因。适合用于制备原核生物目标基因，因为：真核细胞染色体DNA有丰富内含子，它们在原核细胞中转录后不能被剪接。真核细胞基因多数为单拷贝，难以分离到足够量目标基因。4）直接从染色体DNA中分离目标基因61分子生物学基因工程和核酸杂交第61页依据外源DNA特征和受体细胞特征选择适当载体。2、载体选择62分子生物学基因工程和核酸杂交第62页1)粘性末端连接3、目标基因和载体连接本法适合用于在质粒和目标基因上有相同单或双酶切位点。63分子生物学基因工程和核酸杂交第63页粘性末端DNA重组体构建3

HO-G━━━━━CTTAA-p5

5

p-AATTC━━━━━G-OH

3

3

HO-G━━━━━CTTAA-p5

5

p-AATTC━━━━━

G-OH3

质粒目标基因

━━━━━━━━━━━━━━━━目标基因和载体连接EcoRⅠEcoRⅠ碱性磷酸酶3

HO-G━━━━━CTTAA-OH5

5

HO-AATTC━━━━━G-OH

3

退火DNA连接酶

3

HO-G━━━━━CTTAAG━━━━━CTTAA-p5

5

p–AATTC━━━━━GAATTC━━━━━

G-OH3

64分子生物学基因工程和核酸杂交第64页2)平末端连接质粒和目标基因上没有相同酶切位点质粒产生平末端内切酶DNA连接酶目标基因产生粘性末端内切酶产生粘性末端内切酶核酸酶S1核酸酶S165分子生物学基因工程和核酸杂交第65页人工接头本法适合用于在质粒和目标基因上没有相同酶切位点。66分子生物学基因工程和核酸杂交第66页本法适合用于在质粒和目标基因上没有相同酶切位点。经过同聚尾连接67分子生物学基因工程和核酸杂交第67页质粒目标基因

━━━━━━━━━━━━━━━━3

3

3

ACGTC━━━━━G5

5

G━━━━━CTGCA3

3

GnGGGACGTC━━━━━G5

5

G━━━━━CTGCAGGGGn3

3

CnCCC━━━━━5

5

━━━━━CCCCn3

末端转移酶dGTP末端转移酶dCTP混合，退火1）转化细菌2）体内修复同聚尾连接法构建DNA重组体GCCCC━━━━━GGGGACGTC

CTGCAGGGG

━━━━━CCCC

G

PstⅠ

核酸外切酶目标基因和载体连接GACGTCCTGCAGGACGTCCTGCAGCCC

━━━━━━━GGG

GGG

━━━━━━━CCCPstⅠ

PstⅠ

68分子生物学基因工程和核酸杂交第68页4、重组DNA导入受体细胞惯用受体细胞是大肠杆菌。转化（transformation）：是指以质粒DNA或以它为载体构建重组子导入细菌过程。感受态细胞(competentcell)：细胞膜结构改变、通透性增加并含有摄取外源DNA能力细胞。69分子生物学基因工程和核酸杂交第69页制备感受态细胞基本方法CaCl2处理，增加大肠杆菌细胞膜通透性。电击法，高压脉冲使细胞膜形成暂时性微孔。70分子生物学基因工程和核酸杂交第70页1）重组体筛选依据载体抗药性标志筛选

大多数质粒载体带有抗生素抗性基因（如Ampr、Tetr等），当带有完整抗性基因载体转化无抗性细菌后，被转化阳性菌取得抗生素抗性基因而存活并形成菌落，未转化菌不能存活，但应排除未重组空载体。5、重组体筛选和判定71分子生物学基因工程和核酸杂交第71页依据载体抗药性标志插入失活选择一些质粒载体如pBR322质粒中有Ampr和Tetr

抗性基因，在这两个基因中装有几个惯用MCS，如将外源DNA片段插入BamHⅠ识别序列时，则此质粒由Tetr变为对四环素敏感（Tets）。这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素平皿上都能够生长细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素筛选法。72分子生物学基因工程和核酸杂交第72页双抗生素筛选法73分子生物学基因工程和核酸杂交第73页

-半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选法）一些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子lacZ

基因，该基因含一段编码

-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸

-肽DNA片段，IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码缺点型

-半乳糖苷酶实现基因内

-互补，形成完整

-半乳糖苷酶，催化指示剂底物X-gal形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。当外源基因插入lacZ

基因中MCS，lac

-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无

-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是惯用蓝白斑筛选法。74分子生物学基因工程和核酸杂交第74页75分子生物学基因工程和核酸杂交第75页依据插入外源性基因性状进行筛选当细胞生物合成路径中某个酶编码基因失活后，该细胞成为营养缺点型，如导入细胞重组DNA能填补缺点基因，那么培养基中就不需补充相关营养成份，由此可挑选出含重组DNA阳性细菌。76分子生物学基因工程和核酸杂交第76页核酸杂交技术筛选将转化细菌平板转移至硝酸纤维素薄膜上，应用特异性核酸探针对其进行原位杂交，可筛选出阳性克隆。对于噬菌体载体克隆，此法也可经过噬菌斑原位杂交筛选阳性克隆。经过斑点杂交和Southernblot杂交技术筛选。77分子生物学基因工程和核酸杂交第77页2）重组体判定依据重组子大小判定重组子装有外源DNA，分子量较原载体大得多，从挑选菌落中分别提取重组DNA和原载体DNA，直接进行电泳，原载体DNA分子量较小、电泳迁移率较大；而重组DNA因分子量较大而迁移率较小。78分子生物学基因工程和核酸杂交第78页酶切判定分别提取重组载体DNA和原载体DNA，依据已知外源基因两端酶切位点，分别用对应内切酶进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，只出现一条区带是原载体本身，而重组载体还多一条外源DNA片段区带，可依据DNAmark来分析插入DNA片段分子量。79分子生物学基因工程和核酸杂交第79页PCR判定提取重组子DNA，利用插入外源基因两端互补特异引物，对重组子DNA进行PCR扩增。此法不但可分离扩增目标基因，还可对目标基因进行测序。80分子生物学基因工程和核酸杂交第80页DNA序列分析判定DNA序列分析是确定分离DNA是否是特异外源性插入DNA唯一方法（金标准），也是最确定方法。自动化，快速、简便和实用。81分子生物学基因工程和核酸杂交第81页8核酸分子杂交8.1核酸杂交基本原理8.2核酸探针技术8.3核酸分子杂交技术8.4基因芯片82分子生物学基因工程和核酸杂交第82页核酸定性或定量检测基因克隆、突变及其表示研究疾病临床诊疗主要用途83分子生物学基因工程和核酸杂交第83页8.1核酸杂交基本原理核酸变性核酸复性核酸分子杂交84分子生物学基因工程和核酸杂交第84页8.1.1核酸变性变性（denaturation）：在一些理化原因作用下，维系DNA分子二级结构氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。化学键改变：维持双螺旋稳定氢键和疏水键发生断裂，断裂能够是部分或全部，能够是可逆或是非可逆。化学结构改变：DNA变性改变了其空间结构，不包括到其一级结构改变。85分子生物学基因工程和核酸杂交第85页86分子生物学基因工程和核酸杂交第86页DNA变性原因凡能破坏双螺旋稳定性原因都能够成为变性条件。加热极端pH有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）87分子生物学基因工程和核酸杂交第87页变性DNA理化性质溶液黏度降低：DNA双螺旋是紧密“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性结构，DNA黏度显著下降。溶液旋光性发生改变：变性后DNA分子对称性及局部构型改变。紫外吸收增加：DNA变性后，DNA溶液紫外吸收增强。双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸88分子生物学基因工程和核酸杂交第88页增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高现象。89分子生物学基因工程和核酸杂交第89页解链曲线通常利用DNA变性后在波长260nm处吸光度（A260）增加来监测DNA变性过程。假如以温度对A260关系作图，所得曲线称为解链曲线。经典DNA变性曲线呈S型。90分子生物学基因工程和核酸杂交第90页融解温度融解温度（meltingtemperature，Tm）：在热变性过程中，紫外吸收值到达最大值50%时温度称为DNA解链温度或融解温度。暴发式：热变性是在变性温度范围内突发跃变过程，很像结晶到达熔点时融化现象，故名融解温度。狭窄性：变性温度范围很小。91分子生物学基因工程和核酸杂交第91页Tm影响原因DNA分子大小和碱基组成溶液离子强度pH值变性剂92分子生物学基因工程和核酸杂交第92页1、DNA分子大小和碱基组成DNA均一性碱基组成均一性样品组成均一性DNA（G+C）含量93分子生物学基因工程和核酸杂交第93页DNA（G+C）含量在溶剂固定前提下，Tm值高低取决于DNA分子中（G+C）含量。（G+C）含量越高，G-C碱基对越多，Tm值越高。核苷酸≤20bp：Tm=4（G+C）+2（A+T）94分子生物学基因工程和核酸杂交第94页95分子生物学基因工程和核酸杂交第95页2、溶液离子强度溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，需要较高温度才能使DNA变性。离子强度较低时，Tm值较低，而且解链温度范围也较宽。96分子生物学基因工程和核酸杂交第96页3、pH值pH值影响氢键形成。pH值在5-9范围内，Tm值改变不显著。pH值小于4或大于11时，均不利于氢键形成，DNA轻易变性。97分子生物学基因工程和核酸杂交第97页4、变性剂干扰碱基堆积力和氢键形成，所以能够降低Tm值。惯用变性剂有甲酰胺、尿素、甲醛等。

98分子生物学基因工程和核酸杂交第98页8.1.2核酸复性复性（renaturation）：指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构现象，它是变性一个逆转过程。退火（annealing）：热变性DNA普通经迟缓冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。双链DNA、RNA双链区、DNA:RNA杂交双链以及其它异源双链核酸分子都含有此性质。99分子生物学基因工程和核酸杂交第99页核酸复性影响原因温度和时间DNA浓度DNA分子大小和复杂度离子强度100分子生物学基因工程和核酸杂交第100页1、温度和时间普通认为比Tm低25℃左右温度是复性最正确条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一迟缓过程，若在超出Tm温度下快速冷却至低温（如4℃以下），复性几乎是不可能。101分子生物学基因工程和核酸杂交第101页2、DNA浓度DNA复性第一步是两个单链分子间相互作用“成核”。“成核”速度与DNA浓度平方成正比。溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”机会越大。102分子生物学基因工程和核酸杂交第102页3、DNA分子大小和复杂度用非重复碱基对（bp）数表示核酸分子复杂性。简单次序DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）这二种单链序列复性时，互补碱基配对较易实现。次序复杂DNA，如小牛DNA非重复部分（普通以单拷贝存在于基因组中），这种复杂特定序列要实现互补，显然要比上述简单序列困难得多。103分子生物学基因工程和核酸杂交第103页4、离子强度对复性影响增加盐浓度可增加互补链合成双链速度，盐中和DNA单链中磷酸基团负电荷，降低互补链静电排斥。104分子生物学基因工程和核酸杂交第104页8.1.3核酸分子杂交核酸分子杂交（molecularhybridization）:两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补标准缔合成异质双链过程称为分子杂交或核酸分子杂交。105分子生物学基因工程和核酸杂交第105页杂交本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。利用探针（probe）与靶DNA杂交，可识别靶DNA中特异核苷酸序列。106分子生物学基因工程和核酸杂交第106页5.2.2核酸探针技术核酸探针（nucleicacidprobe)：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测已知被标识核酸分子。107分子生物学基因工程和核酸杂交第107页选择探针基本标准高度特异性探针起源是否方便制备探针难易程度108分子生物学基因工程和核酸杂交第108页8.2.1核酸探针类型基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针109分子生物学基因工程和核酸杂交第109页起源：这类探针起源于某种生物基因组，多为某一基因全部或部分序列。制备方法:基因克隆方法聚合酶链反应(PCR)特点:多克隆在载体中DNA片段，可无限繁殖，取之不尽。PCR制备探针简便和省时。相对RNA而言，DNA探针不易降解，标识方法也较成熟。1、基因组DNA探针110分子生物学基因工程和核酸杂交第110页cDNA(complementaryDNA)：是指与mRNA互补DNA分子。特点:不存在内含子和高度重复序列，是一个较理想核酸探针，尤其是用于基因表示研究。排除了RNA酶影响，现已成为分子生物学试验室常规试验。cDNA探针111分子生物学基因工程和核酸杂交第111页RNA探针与靶序列杂交效率较高，稳定性也高。RNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链竞争结合。RNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少，杂交后未杂交探针分子水解可用RNA酶去除，本底干扰低。RNA探针有易降解和标识方法复杂等缺点，限制了其广泛应用。

RNA探针112分子生物学基因工程和核酸杂交第112页依据需要来合成对应核酸序列，防止天然探针缺点。探针长度普通为10～50bp。尤其适合点突变检测。因为探针长度较短，特异性较低，杂交信号较弱，但经过精心设计仍可设计出非常特异寡核苷酸探针。寡核苷酸探针113分子生物学基因工程和核酸杂交第113页探针长度：普通要求在10～50bp。

G／C含量为40％～60％。探针分子中应防止互补序列。防止同一碱基连续出现，普通不能多于4个，如GGGG-或-CCCC-。借助计算机对应软件与已知各种基因序列进行同源性比较。探针设计标准114分子生物学基因工程和核酸杂交第114页理想探针标识物应含有以下特点：检测物要灵敏、特异、稳定、简便。标识物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值。标识物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。标识物对检测方法无干扰。

8.2.2核酸探针标识和检测115分子生物学基因工程和核酸杂交第115页惯用核酸探针标识和检测标识分子标识方法检测方法[α32P]dNTPNT、PCR、RP放射自显影或液闪计数[γ32P]dNTPTL放射自显影或液闪计数35SNT放射自显影或液闪计数3HNT放射自显影或液闪计数Bio-11-dUTPNT、PCR、RP酶标亲和素或酶标抗体显色光敏生物素可见光照射酶标亲和素或酶标抗体显色生物素化补骨脂素紫外线照射酶标亲和素或酶标抗体显色HRP和ALP化学法或直接法酶促底物显色FITC和罗丹明合成法荧光显微镜观察地高辛RP、NT酶标抗体+底物显色116分子生物学基因工程和核酸杂交第116页8.3核酸分子杂交技术5.2.3.1固相核酸分子杂交5.2.3.2原位核酸分子杂交5.2.3.3液相核酸分子杂交5.2.3.4核酸分子杂交试验条件优化

117分子生物学基因工程和核酸杂交第117页分子杂交技术普通流程探针制备及标识（同位素或非同位素）待测核酸样品制备（分离，纯化）杂交（液相，固相，原位杂交）杂交后处理（去掉非特异杂交分子）显示结果（显色，发光，放射自显影）结果分析118分子生物学基因工程和核酸杂交第118页核酸分子杂交技术类型

杂交类型检测对象Southern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上DNA分子Northern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上RNA分子菌落杂交检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放DNA分子正向斑点杂交检测固定在膜上DNA或RNA分子反向斑点杂交检测样品中DNA或RNA分子微板杂交检测固定微板孔上DNA或RNA分子原位杂交检测细胞或组织上DNA或RNA分子119分子生物学基因工程和核酸杂交第119页固相分子杂交：是将待测靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标识探针杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。固体杂交优点：未杂交游离探针经过漂洗可轻易除去，膜上杂交分子轻易检测，还能预防靶DNA自我复性，所以被广泛应用。8.3.1固相核酸分子杂交120分子生物学基因工程和核酸杂交第120页DNA变性中和Southern印迹预杂交杂交洗膜检测

1、Southern印迹杂交（Southernblot）121分子生物学基因工程和核酸杂交第121页

毛细管转移示意图122分子生物学基因工程和核酸杂交第122页电转移示意图123分子生物学基因工程和核酸杂交第123页Northern印迹杂交是应用DNA探针检测特异mRNA一个膜上印迹技术。是由Alwine于1977年建立，后经Thomas等人改进。用于分析mRNA分子大小及mRNA转录情况。2、Northern印迹杂交（Northernblot）124分子生物学基因工程和核酸杂交第124页Northern印迹杂交流程图

125分子生物学基因工程和核酸杂交第125页与Southern印迹杂交不一样点RNA提取过程中需尤其注意RNA酶污染。所用器材最好与Southern印迹试验分开使用。RNA变性方法：不能用碱变性，因为碱会水解RNA2‘-羟基基团，在变性剂存在下进行电泳，预防RNA分子形成发夹式二级结构，以保持其单链线形状态。印迹前将含变性剂凝胶用水冲洗掉，再印迹、杂交。假如测定RNA片段大小，可在同一块胶上加分子量标识物一同电泳，之后将标识物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。126分子生物学基因工程和核酸杂交第126页斑点杂交是将待检样品（DNA、RNA或细胞）直接点到膜上，烘烤固定。3、斑点杂交（Dot-blot）127分子生物学基因工程和核酸杂交第127页斑点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速。但结果无法判断核酸片段大小，也无法判断样品溶液中是否存在着不一样靶序列。多用作核酸定性或半定量分析，而且便于杂交条件探索。128分子生物学基因工程和核酸杂交第128页菌落杂交示意图4、菌落杂交129分子生物学基因工程和核酸杂交第129页微板酶联夹心杂交动画流程NOS基团捕捉探针PCR产物检测探针亲和素-HRP四甲基联苯氨氨基生物素5、微板酶联杂交130分子生物学基因工程和核酸杂交第130页捕捉探针共价结合在