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文档简介
第四章叶绿素荧光技术应用
叶绿素荧光
叶绿素荧光作为光合作用研究的探针,得到了广泛的研究和应用。叶绿素荧光不仅能反映光能吸收、激
发能传递和光化学反应等光合作用的原初反应过程,而且与电子传递、质子梯度的建立及ATP合成和CO
2固定等过程有关。几乎所有光合作用过程的变化均可通过叶绿素荧光反映出来,而荧光测定技术不需
破碎细胞,不伤害生物体,因此通过研究叶绿素荧光来间接研究光合作用的变化是一种简便、快捷、可
靠的方法。目前,叶绿素荧光在光合作用、植物胁迫生理学、水生生物学、海洋学和遥感等方面得到了
广泛的应用。
1叶绿素荧光的研究历史
叶绿素荧光现象是由传教士Brewster首次发现的。1834年Brewster发现,当一束强太阳光穿过月桂叶
子的乙醇提取液时,溶液的颜色变成了绿色的互补色¬¬——
红色,而且颜色随溶液的厚度而变化,这是历史上对叶绿素荧光及其重吸收现象的首次记载。后来,Sto
kes(1852)认识到这是一种光发射现象,并使用了“fluorescence”一词。
1874年,Miiller发现叶绿素溶液稀释后,荧光强度比活体叶子的荧光强得多。尽管MiiHer提出叶绿
素荧光和光合作用之间可能存在相反的关系,但由于他的实验没有对照,实验条件控制不严格,因此人
们并没有将叶绿素荧光诱导(瞬变)现象的发现归功于Miiller。
Kautsky是公认的叶绿素荧光诱导现象的发现者。1931年,Kautsky和Hirsch用肉眼观察并记录了叶绿
素荧光诱导现象(Lichtenlhaler,1992;Govindjee,1995)o他们将暗适应的叶子照光后,发现叶绿素荧光
强度随时间而变化,并与C02的固定有关。他们得到的主要结论如下:1)叶绿素荧光迅速升高到最高点
,然后下降,最终达到一稳定状态,整个过程在几分钟内完成。2)曲线的上升反映了光合作用的原初
光化学反应,不受温度(0℃和30℃)和HCN处理的影响。若在最高点时关掉光,则荧光迅速下降。3)
荧光强度的变化与C02的固定呈相反的关系,若荧光强度下降,则CO2固定增加。这说明当荧光强度降
低时,较多的光能用于转变成化学能。4)奇怪的是(照光后)C02的固定有一个延滞期,似乎说明“光
依赖''的过程对C02固定过程的进行是必需的。另一个未得到解释的现象是若在荧光诱导结束后关掉光,
则荧光水平的恢复需要很长时间。在Kautsky的发现之后,人们对叶绿素荧光诱导现象进行了广泛而深入
的研究,并逐步形成了光合作用荧光诱导理论,被广泛应用于光合作用研究。由于Kautsky的杰出贡献,
叶绿素荧光诱导现象也被称为Kautsky效应(KautskyEffect)。
2叶绿素荧光的产生及其量子产量
细胞内的叶绿素分子通过直接吸收光量子或间接通过捕光色素吸收光量子得到能量后,从基态(低
能态)跃迁到激发态(高能态)。由于波长越短能量越高,故叶绿素分子吸收红光后,电子跃迁到最低
激发态;吸收蓝光后,电子跃迁到比吸收红光更高的能级(较高激发态)。处于较高激发态的叶绿素分
子很不稳定,在几百飞秒(fs,lfs=l(T
,5s)内,通过振动弛豫向周围环境辐射热量,回到最低激发态。最低激发态的叶绿素分子可以稳定存在
几纳秒(ns,lns=10'9s)。
处于较低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径释放能量回到稳定的基态。能量的释放方式有如下
几种(图3.3)(Campbelletal.,1998;Rohaček&Bartak,1999;Malkin&
Niyogi,2000):1)重新放出一个光子,回到基态,即产生荧光。由于部分激发能在放出荧光光子之前
以热的形式逸散掉了,因此荧光的波长比吸收光的波长长,叶绿素荧光一般位于红川区。2)不放出光
子,直接以热的形式耗散掉(非辐射能量耗散)。3)将能量从一个叶绿素分子传递到邻近的另一个叶
绿素分子,能量在一系列叶绿素分子之间传递,最后到达反应中心,反应中心叶绿素分子通过电荷分离
将能量传递给电子受体,从而进行光化学反应。以上这3个过程是相互竞争的,往往是具有最大速率的
过程处于支配地位。对许多色素分子来说,荧光发生在纳秒级,而光化学发生在ps级,因此当光合生物
处于正常的生理状态时,天线色素吸收的光能绝大部分用来进行光化学反应,荧光只占很小的一部分。
活体细胞内由于激发能从叶绿素b到叶绿素a的传递几乎达到100%的效率,因此检测不到叶绿素b荧
光。在室温下,绝大部分(约90%)的活体叶绿素荧光来自PSH的天线色素系统,而且光合器官吸收的
能量只有约3%〜5%用于产生荧光(林世青,1996;Krause
&Weis,1991)。
3调制叶绿素荧光
调制叶绿素荧光全称脉冲-振幅-调制(Pulse-Amplitude-
Modulation,PAM)叶绿素荧光,我们国内一般简称调制叶绿素荧光,测量调制叶绿素荧光的仪器叫调制
荧光仪,或叫PAM。
调制叶绿素荧光(PAM)是研究光合作用的强大工具,与光合放氧、气体交换并称为光合作用测量
的三大技术。由于其测量快速、简单、可靠、且测量过程对样品生长基本无影响,目前已成为光合作用
领域发表文献最多的技术。
4调制叶绿素荧光仪的工作原理
1983年,WALZ公司首席科学家,德国乌兹堡大学教授Ulrich
Schreiber博士利用调制技术和饱和脉冲技术,设计制造了全世界第一台脉冲振幅调制(Pulse-Amplitude-
1
第四章叶绿素荧光技术应用
Modulation,PAM)荧光仪PAM-101/102/103。
所谓调制技术,就是说用于激发荧光的测量光具有一定的调制(开/关)频率,检测器只记录与测量
光同频的荧光,因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光,包括背景光很强时。正是由于调制技
术的出现,才使得叶绿素荧光由传统的“黑匣子”(避免环境光)测量走向了野外环境光下测量,由生理
学走向了生态学。
所谓饱和脉冲技术,就是打开一个持续时间很短(一般小于1s)的强光关闭所有的电子门(光合作
用被暂时抑制),从而使叶绿素荧光达到最大。饱和脉冲(SaturationPulse,
SP)可被看作是光化光的一个特例。光化光越强,PS
n释放的电子越多,PQ处累积的电子越多,也就是说关闭态的电子门越多,F越高。当光化光达到使所
有的电子门都关闭(不能进行光合作用)的强度时,就称之为饱和脉冲。
打开饱和脉冲时,本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热,F
达到最大值。
经过充分喑适应后,所有电子门均处于开放态,打开测量光得到Fo,此时给出一个饱和脉冲,所有
的电子门就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光和热,此时得到的叶绿素荧光为Fm。根据Fm和Fo
可以计算出PSII的最大量子产量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm,它反映了植物的潜在最大光合能力。
在光照下光合作用进行时,只有部分电子门处于开放态。如果给出一个饱和脉冲,本来处于开放态
的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热,此时得到的叶绿素荧光为Fm,。根据Fm,和
F可以求出在当前的光照状态下PSII的实际量子产量Yield=<J>PSn=AF/Fm,=(Fm,-
F)/Fm\它反映了植物目前的实际光合效率。
在光照下光合作用进行时,只有部分电子门处于关闭态,实时荧光F比Fm要低,也就是说发生了荧
光淬灭(quenching)。植物吸收的光能只有3条去路:光合作用、叶绿素荧光和热。根据能量守恒:1=
光合作用+叶绿素荧光+热。可以得出:叶绿素荧光=1一光合作用一热。也就是说,叶绿素荧光产量
的下降(淬灭)有可能是由光合作用的增加或热耗散的增加引起的。由光合作用的引起的荧光淬灭称之
为光化学淬灭(photochemicalquenching,qP);由热耗散引起的荧光淬灭称之为非光化学淬灭(non
photochemicalquenching,
qN或NPQ)。光化学淬灭反映了植物光合活性的高低;非光化学淬灭反映了植物耗散过剩光能为热的能
力,也就是光保护能力。
光照状态下打开饱和脉冲时,电子门被完全关闭,光合作用被暂时抑制,也就是说光化学淬灭被全
部抑制,但此时荧光值还是比Fm低,也就是说还存在荧光淬灭,这些剩余的荧光淬灭即为非光化学淬灭
。淬灭系数的计算公式为:qP=(Fm'-Fs)的v'=l-(Fs-Fo')/(Fm'-Fo');qN=(Fv-Fv,)/Fv=l-(Fm,-Fo,)/(Fm-
Fo);NPQ=(Fm-Fm,)/Fm,=Fm/Fm,-l»
当F达到稳态后关闭光化光,同时打开远红光(Far-redLight,FL)(约持续3—5s),促进PS
I迅速吸收累积在电子门处的电子,使电子门在很短的时间内回到开放态,F回到最小荧光Fo附近,此时
得到的荧光为Fo,由于在野外测量Fo,不方便,因此野外版的调制荧光仪(除PAM-2100和WATER-
PAM)外,多数不配置远红光。此时可以直接利用Fo代替Fo,来计算qP和qN,尽管得到的参数值有轻微
差异,但qP和qN的变化趋势与利用F。,计算时是一致的。由于NPQ的计算不需F。,,近10几年来得到了越
来越广泛的应用。
根据PSII的实际量子产量AF/FrrT和光合有效辐射(PhotosyntheticallyActive
Radiation,PAR)还可计算出光合电子传递的相对速率rETR=AF/Fm'•PAR•0.84•0.5
。其中0.84是植物的经验性吸光系数,0.5是假设植物吸收的光能被两个光系统均分。
5著名调制叶绿素荧光仪简介
PAM-
101/102/103,最经典的型号,虽已停产,但在国际最著名的光合作用实验室,仍是主打机型,原因很简
单,它老不坏啊,呵呵
PAM-2000/PAM-2100,最畅销的便携式机型,应用非常广泛
MINLPAM,比PAM-2100便宜,功能同样强大
DIVING-
PAM,全球第一台可水下原位测量植物生理的仪器,仪器全防水设计,在珊瑚研究领域应用非常广泛
IMAGING-
PAM,新型荧光成像系统,最有意思的是一个主机可以连接多个探头,功能超级强大,是“下一代”产品
DUAL-PAM-
100,同步测量叶绿素荧光和P700,也就是同时研究PSII和PSI活性,在技术上有重大革新等等。
2
第四章叶绿素荧光技术应用
第一节叶绿素荧光参数及其意义
叶绿素荧光技术作为光合作用的经典测量方法,已经成为藻类生理生态研究领域功能最强大、使用最广
泛的技术之一。由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统II的叶绿素a,而光系统II处于整个光合作
用过程的最上游,因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统II,进而引起叶
绿素a荧光的变化,也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量方
法相比,叶绿素荧光技术还具有不需破碎细胞、简便、快捷、可靠等特性,因此在国际上得到了广泛的应用。
1叶绿素荧光的来源
藻细胞内的叶绿素分子既可以直接捕获光能,也可以间接获取其它捕光色素(如类胡萝卜素)传递来
的能量。叶绿素分子得到能量后,会从基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)。根据吸收的能量多少,
叶绿素分子可以跃迁到不同能级的激发态。若叶绿素分子吸收蓝光,则跃迁到较高激发态;若叶绿素分析吸
收红光,则跃迁到最低激发态。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定,会在几百飞秒(fs,1fS=10-5
s)内通过振动弛豫向周围环境辐射热量,回到最低激发态(图1)。而最低激发态的叶绿素分子可以稳定
存在几纳秒(ns,1ns=109s)(.
A较高激发态
热耗散
求最低激发态
能量溺
3与
荧光
基态
图I叶绿素吸收光能后能级变化(A)和对应的吸收光谱(B)(引自韩博平etal..2003)
处于最低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径(图2)释放能量回到基态(韩博平etal.,2003;
Schreiber,2004):1)将能量在一系列叶绿素分子之间传递,最后传递给反应中心叶绿素a,用于进行光化
学反应;2)以热的形式将能量耗散掉,即非辐射能量耗散(热耗散);3)放出荧光。这三个途径相互竞
争、此消彼长,往往是具有最大速率的途径处于支配地位。一般而言,叶绿素荧光发生在纳秒级,而光化学
反应发射在皮秒级(ps,1ps=10l2s),因此在正常生理状态下(室温下),捕光色素吸收的能量主要用于
进行光化学反应,荧光只占约3%~5%(KrauseandWeis,1991;林世青etal.,1992)。
在活体细胞内,由于激发能从叶绿素b到叶绿素a的传递几乎达到100%的效率,因此基本检测不到
叶绿素b荧光。在常温常压下,光系统I的叶绿素a发出的荧光很弱,基本可以忽略不计,对光系统I叶
绿素a荧光的研究要在77K的低温下进行。因此,当我们谈到活体叶绿素荧光时,其实指的是来自光系统
II的叶绿素a发出的荧光。
3
第四章叶绿素荧光技术应用
2叶绿素荧光的研究历史
在19世纪就有了关于叶绿素荧光现象的记载。最初是在1834年由欧洲传教士Brewster发现,当强光
穿过月桂叶子的乙醇提取液时,溶液的颜色由绿色变成了红色。1852年Stokes认识到这是一种光发射现象,
并创造了"fluorescence”一词。
1931年,德国科学家Kautsky和Hirsch用肉眼观察并记录了叶绿素荧光诱导现象,明确指出暗适应处
理的叶片照光后的诱导过程中,叶绿素荧光强度的变化与C02固定呈相反的关系(KautskyandHirsch,1931;
Govindjee,1995),此后的10余年中,Kautsky和他的学生Franck就这一现象作了系统的研究(Kautskyand
Franck,1943)。在Kautsky研究的基础上,后人进一步对叶绿素荧光诱导现象进行了广泛而深入的研究,
并逐步形成了光合作用荧光诱导理论,被广泛应用于光合作用研究。由于Kautsky的杰出贡献,叶绿素荧
光诱导现象也被称为Kautsky效应(KautskyEffect)。
从1960年代到1980年代早期,叶绿素荧光这一生物物理学的技术被广泛用于光合作用基础研究,很
多重要发现都与这一技术有关,如光合作用存在两个光反应的提出(DuysensandSweers,1963)就是采用的这
一技术应用的典型代表。但在那个年代,所有的叶绿素荧光测量都只能在完全遮蔽环境光的“黑匣子”里
进行,这大大限制了叶绿素荧光技术在植物胁迫生理学、生理生态学和植物病理学等领域的应用。因此在很
长一段时间中,叶绿素荧光技术在基础研究和应用研究的使用中存在一个鸿沟。尽管如此,情况还是在逐步
好转。这是因为虽然叶绿素荧光信号虽然复杂,但确实提供了可靠的、定量的信息,并且可以由越来越小型
化的仪器来进行测量。
1980年代中期,德国乌兹堡大学的Schreiber提出了叶绿素荧光测量的饱和脉冲理论,并发明了脉冲-
振幅-调制(Pulse-Amplitude-Modulation)叶绿素荧光仪(Schreiber,1986;Schreiberetal,1986),也就是今天
大名鼎鼎的调制叶绿素荧光仪PAMoSchreiber早年师从Kautsky的学生Franck,在后者的指导下很早就开
始进行叶绿素荧光研究(Schreiberetal.,l971;Gielenetal.,2007),并在1975年就设计出了科研界第一款便
携式叶绿素荧光仪(Schreiberetal.,1975)。但受限于光电技术的发展,当时这款荧光仪只能测量叶绿素荧光诱
导曲线,不能进行深入的淬灭分析,直到PAM的出现才解决了这个问题。
调制叶绿素荧光仪PAM和调制叶绿素荧光测量技术在叶绿素荧光的研究历史上具有里程碑意义。它采
用了调制技术进行测量,从而可以在有环境光照(甚至是很强的太阳光)的情况下记录叶绿素荧光信号;
4
第四章叶绿素荧光技术应用_________________________________________
它采用了饱和脉冲技术,使得光化学淬灭和非光化学淬灭的测量成为可能。PAM面世后,很快就替代了传
统的光合放氧和C02同化技术,成为使用最广泛的光合活性测量技术。
早期的调制叶绿素荧光仪主要在实验室内进行测量,到了1990年代发展到可以非常方便的在野外现
场测量。早期的仪器采用光电二极管作为检测器,只能测量叶片或细胞浓度很高的藻液,后来采用光电倍增
管后可以直接检测大洋海水的叶绿素荧光。随着技术的发展,陆续出现了叶绿素荧光成像测量技术、水下原
位叶绿素荧光测量技术、显微叶绿素荧光测量技术、无线远程叶绿素荧光测量技术和利用叶绿素对浮游植物
进行分类的技术等,这些技术均在藻类学界得到了广泛的应用。
3调制叶绿素荧光原理
为了更好的理解调制叶绿素荧光,首先要知道“荧光强度(intensity)”和“荧光产量(yield)”的区别。
“荧光强度”的高低依赖于激发光的强度和仪器的信号放大倍数,其变化可以达到几个数量级的幅度。而“荧光
产量”可以理解为固定仪器设置下的荧光强度,其变化不会超过5-6倍,是真正包含了光合作用信息的参数。
例如针对一个暗适应处理后的样品,照射0.5Nmolnr?5的测量光后,其荧光产量是非常稳定的。假设此时
仪器的增益设置为1,荧光强度为300mV;当仪器的增益设置改为3后,荧光强度变为
900mV。但实际上由于激发光恒定,样品发出的荧光产量是恒定的,只是在不同的信号放大倍数下检测到的
荧光强度不同而已。
理想的荧光仪必须能在不改变样品状态的情况下(即非破坏性)进行生理活性测量,需要满足如下几
条要求(Schreiber,1986;Schreiberetal.,1986;Schreiber,2004):
1)测量光必须足够低,只激发色素的本底荧光而不引起光合作用,这样才能获得暗适应后的最
小荧光Fo;
2)测量光由一系列微秒级的光脉冲组成,这些短光脉冲可以不同的频率给出。在很低的频率下,
即使单个微秒级光脉冲的强度比较高,也不会引起光合作用;
3)用反应迅速、线性范围大的光电二极管(或光电倍增管)来检测这些由微秒级测量光脉冲激
发的微秒级荧光脉冲;
4)荧光脉冲信号首先由交流耦合放大器放大,然后进一步经选择性锁相放大器处理,只放大和
调制测量光同频率的荧光信号,可以有效屏蔽环境中本身就存在的与叶绿素荧光同波长的背
景噪音(这就好比选择调频收音机的某个频道,就可以在浩如烟海的无线电波噪音中获得选
择性接收您需要的无线电波,采用调制技术,可以在大量的环境光背景噪音中选择性测量叶
绿素a发出的荧光);
5)当打开光化光或饱和脉冲时,可以自动提高测量光频率,以提高信号采点率,有效记录一些
比较快速的荧光动力学变化(如荧光快速上升动力学)。
调制叶绿素荧光仪有两大核心技术,一个是上文提到的光调制技术,有了它才能使得我们在有环境光的
情况下测量叶绿素荧光;另一个就是饱和脉冲技术。
所谓饱和脉冲技术,就是提供一个瞬间的强光脉冲,来暂时打断光系统II电子传递过程。我们已经知道,
光合机构吸收的光能有三条去激途径:光化学反应(Photochemistry,P),叶绿素荧光(Fluroescence,F)和热耗
散(Dissipation,D)。根据能量守恒原理,假设吸收的光能为常数1,得到1=P+F+D。叶绿素荧光产量可以测
量出来,而我们希望得出P和D两个参数。根据基本的数学原理,一个等式有两个未知数是无解的。此时如
果给出一个饱和脉冲,暂时打断光化学反应过程,则P=0,这个等式就可以求解了•由此可知,饱和脉冲技
术的基本作用就是打断光合作用,用于求出光化学反应和热耗散分别用去了多少能量。
早期,科研人员只能通过人为加入农药敌草隆(DCMU)来阻断光系统II的电子传递过程,从而获得
最大荧光Fm,而这是不可逆的。后来,Schreiber在"光强倍增"技术(BradburyandBtiker,1981;Quickand
Horton,1984)的基础上提出了"饱和脉冲"技术(Schreiberetal.,1986)«饱和脉冲技术的最大优点在于,它
是暂时阻断光系统II的电子传递过程,由于持续时间很短(一般0.2-1.5s),因此饱和脉冲关闭后光合电
子传递会在极端的时间内恢复运转。所以说这是一种可逆的过程,正是有了饱和脉冲技术,我们才能不破
5
第四章叶绿素荧光技术应用
坏样品的完整性就获得其光合生理参数。
4叶绿素荧光诱导曲线和典型参数
从Kautsky发现叶绿素荧光诱导现象并提出其与光合作用的关系后,80多年来利用叶绿素荧光研究光
合作用采用的最主要技术就是荧光诱导曲线。那么什么是叶绿素荧光诱导曲线呢?测量叶绿素荧光诱导曲
线能获得哪些生物信息呢?
所谓叶绿素荧光诱导,就是将样品在黑暗的状态下适应一段时间,然后照射光化光,观察样品的光合机
构从暗转到光下的响应过程。为什么要暗适应呢?在光合电子传递链上有一个叫做质体酸(PQ)的载体,是
整个电子传递过程的限速步骤,可以通俗的称之为电子门。在光合膜上PQ的数量与捕光色素吸收的光子数
(微摩尔级)相比是微不足道的。因此光合作用进行时,光系统H释放出的电子总是有部分会累积在电子门
PQ处,这部分处于还原态(累积电子)的电子门就处于关闭态,或者说光系统II的反应中心处于关闭态。
在暗适应过程中,光系统II无法获得光能激发,因此不会继续释放电子,累积在PQ处的电子会继续往光系
统I传递,直到所有电子都传递完毕。当PQ处不再累积电子后,暗适应就足够了。
暗适应结束后,就可以照光进行荧光诱导了。那么采用什么光进行诱导呢?只要能够引起光合作用的光
也就是波长在400-700nm的可见光,都可以进行荧光诱导,我们给它一个专业术语叫做光化光(Actinic
Light),也有人翻译为作用光。在光合作用领域,400-700nm的光也被称为光合有效辐射(Photosynthetic
ActiveRadiation,PAR),光化光可以为人工光,如来自日光灯、卤素灯或发光二极管的光,也可以为自然
光(直接或间接的太阳光)。但为了使我们的实验具有可重复性,多数荧光诱导的测量会采用仪器提供的
恒定光强的人工光(新型仪器多以光强稳定的发光二极管为主)来诱导。只有保证测量条件一致,才能对
不同材料或不同处理的样品进行直接比较。
MLonALonALoffMLoff
Time
图3叶绿素荧光诱导曲线(韩志国and吕中贤,未发表数据)
SP,饱和脉冲(SaturationPulse);AL,光化光(ActinicLight)«
Fo,最小荧光:Fm,最大荧光。
整个测量过程中调制测量光需要一直打开。
图3是一条典型的叶绿素荧光诱导曲线,其测量步骤如下:
1)样品首先暗适应处理一段时间,以便累积在PQ处的所有电子都被传走,光系统II的所有反应
中心都处于开放态。然后打开测量光(MeasuringLight,ML),记录暗适应后的最小荧光Fo。测
量光很弱(一般小于1pmolnr2s」),只激发色素的本底荧光但不足以引起任何的光合作用。
6
第四章叶绿素荧光技术应用_________________________________________
2)紧接着打开一个持续时间仅有021.5s的饱和脉冲(SaturationPulse,SP),测量暗适应后的
最大荧光Fm。饱和脉冲打开后,由光系统II处释放的电子迅速将PQ全部还原(电子门全部
关闭),光化学反应被打断,光能全部转化为叶绿素荧光和热量,荧光迅速达到最大值Fm。
饱和脉冲的强度非常强,高等植物一般要求达到8000-10000pmolm2s'藻类一般大于4000
pmolnr2s"即可。
3)饱和脉冲关闭后荧光迅速回到Fo附近,然后打开光化光(ActinicLight,AL),记录叶绿素荧光
从黑暗转到光照的响应过程。如上所述,光合作用进行时,总是有部分电子门处于关闭态。这部
分处于关闭态的电子门本应用于光合作用的能量就转化为了叶绿素荧光和热。饱和脉冲关闭
后,电子门迅速全部打开。此时打开光化光,光系统H瞬间释放出大量电子,导致许多电子门
被关闭,因此实时荧光迅速上升。此时,光合器官会迅速启动调节机制来适应这种光照状态,
光系统I逐渐从PQ处获取电子。在恒定的光化光强度下,PSII释放的电子数是恒定的,因此
随着时间的延长,处于关闭态的电子门越来越少,荧光逐渐下降并达到稳态。此时,处于关闭
态的电子门数量达到动态平衡,也就是说光系统II和光系统I达到了动态平衡。
4)等荧光曲线达到稳态后关闭光化光,并结束整个测量过程。有时,为了精确的获得Fo,这个参数,
会在关闭光化光的同时打开一个持续几秒的远红光(Far-redLight,FL)(图3中未示出),以加
快电子从PQ向光系统I的传递。
根据图3中的Fo和Fm,可以计算出光系统II的最大光合效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm(KilajimaandButler,
1975),它反映了植物的潜在最大光能转换效率。这是用得最广、使用频率最高的一个参数。早在1987年科
研人员就已经阐明多数健康维管束植物的Fv/Fm值为0.832±0.004(Bj6rkmanandDemmig,1987)。目前科研界
已基本达成共识,在健康生理状态下,绝大多数高等植物的Fv/Fm在0.8-0.85之间,当Fv/Fm下降时,代表
植物受到了胁迫。因此,R/Fm是研究光抑制或各种环境胁迫对光合作用影响的重要指标。
对藻类而言,由于其进化程度差异大,健康生理状态下的Fv/Fm没有很固定的值。但笔者结合大量文献
报道和实际经验,总结出了一些基本的规律。如绿藻门的最大Fv/Fm一般在0.7-0.75之间,没有很大的种
间差异性;硅藻门和甲藻门的最大Fv/Fm一般在0.65-0.7之间,也没有很大的种间差异性。对蓝藻门和红
藻门而言,由于其捕光结构为藻胆体,而藻胆体可以在光系统II和光系统I之间滑动,造成不同的藻之间
没有可以直接比较的最大Fv/Fm值。
若在打开光化光进行叶绿素荧光诱导的过程中,间隔一段时间打开一个饱和脉冲,则可以将光化学反
应和热耗散计算出来。图4就是利用这种方法测量出的叶绿素荧光诱导曲线。
Time
图4带淬灭分析的叶绿素荧光诱导曲线(韩志国and吕中贤,未发表数据)
打开光化光进行光合诱导时,在PQ处会累积电子,只有部分电子门处于开放态。如果给出一个饱和
7
第四章叶绿素荧光技术应用_________________________________________
脉冲,本来处于开放态的电子门将本该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热,此时得到的叶绿素荧
光峰值为Fnf(图4),而打开饱和脉冲之前记录的荧光值为F。根据Fm,和F可以求出在当前的光照状态
下光系统II的实际光合效率Y(Il)=ePsu=AF/Fm,=(Fm,-F)/Fm,(Gentyetal.,1989),它反映了光合机构目前
的实际光能转换效率。
从图4中可以看出,在荧光诱导过程中,不仅F会逐渐达到稳态,Fm,也会逐渐达到稳态。实际上,
只有F和Fm,都达到稳态了,也就是Y(H)达到稳态了,才是真正的达到了稳态光合作用阶段。
如图4所示,在光化光照射下,只有部分电子门处于关闭态,因此实时荧光F比Fm要低,也就是说
发生了荧光淬灭(quenching),如上文所述,根据能量守恒定律,1=P+F+D,那么F=l-P-Do也就是说,
叶绿素荧光产量的下降(淬灭)可以由光合作用的增加引起,也可以由热耗散的增加引起。由光合作用的
引起的荧光淬灭称之为光化学淬灭(photochemicalquenching,qP或qL),由热耗散引起的荧光淬灭称之
为非光化学淬灭(non-photochemicalquenching,qN或NPQ)。光化学淬灭反映了植物光合活性的高低;
非光化学淬灭反映了植物耗散过剩光能为热的能力,也就是光保护能力。
光照状态下打开饱和脉冲时,电子门被完全关闭,光合作用被暂时抑制,也就是说光化学淬灭被全部抑
制,但此时荧光值还是比Fm低(图4),也就是说还存在荧光淬灭,这些剩余的荧光淬灭即为非光化学淬
灭。淬灭系数的计算公式为(Schreiberetal.,1986;vanKootenandSnel,1990;KrameretaL,2004):
qP=(Fm,-F)/Fv,=l-(F-Fo,)/(Fm,-Fo,);
qL=(Fm,-F)/(Fm,-Fo,)Fo7F=qP-Fo7F;
qN=(Fv-Fv,)/Fv=l-(Fm,-Fo,)/(Fm-Fo);
NPQ=(Fm-Fm,)/Fm,=Fm/Fm,-l<,
从公式中可以看出,qP、qL和qN的计算都需要Fo,这个参数,而Fo,的测量需要打开远红光,在野
外现场测量时不太方便。因此很多文献中采用了用Fo代替Fo,来计算淬灭系数(Jonesetal.,1998;Whiteand
Critchley,1999),或者用公式Fo,=Fo/(Fv/Fm+Fo/Fm,)来获得Fo'后再计算淬灭系数(OxboroughandBaker,
1997)的方法,尽管得到的参数值有轻微差异,但参数的变化趋势与利用Fo,计算时是一致的。
对光化学淬灭而言,基于光合单位“沼泽”模型建立的qP已经被实践证明规律性不强,自从基于“湖泊”
模型的qL出现后,qP用的越来越少,而qL用的越来越多(Krameretal.,2004)。对非光化学淬灭而言,
qN和NPQ两个参数都经常使用,由于NPQ的计算不需测量Fo\因此越来越多的人喜欢使用它(Ralphand
Gademann,2005)。
1996年,为了表征光系统II吸收的激发能的去向,Genty等(Caillyetal.,1996;Gentyetal.,1996)提出
了三个互补的量子产量参数①II=(Fm,-F)/Fm,、①NPQ=F/Fm=F/Fm和①NO=F/Fm,即现在通常所说的Y(H)、
Y(NPQ)和Y(NO),且Y(II)+Y(NPQ)+Y(NO)=1。有意思的是,由于这三个参数是在两个学术会议上提出的,
并没有在学术期刊上正式发表文献,因此直到2(X)4年一直未被引用。2004年,Kramer等基于光合单位的
“湖泊”模型,推演出了qL、<I>NPQ=1-Y(II)-1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1))^0①NO=l/(NPQ+l+qL(Fm/Fo-l))(即
Y(NPQ)和Y(NO))参数(Krameretal.,2004),并在当年就被Schreiber将这些参数添加到了PAM系列调制
叶绿素荧光仪的软件中。在Kramer等(2004)的公式中,①NPQ和①NO的计算都需要qL,也就是需要测量
Fo\这增加了两个参数的测量难度。
2008年,Klughammer和Schreiber撰文重新推导了Genty等提出的公式,发现Genty等的公式不仅适
用于“湖泊”模型,也适用于“沼泽”模型,其适用性更强,且无需测量Fo,参数,在实际应用中比Kramer等
的公式更好用(KlughammerandSchreiber,2008)<,那么这几个参数的生物学意义是什么呢?我们已经知道
Y(II)代表光系统II吸收后用于光化学反应的那部分能量,剩余的未做功的能量可以分成两个部分Y(NO)
和Y(NPQ)。Y(NO)代表的是被动的耗散为热量和发出荧光的能量,主要由关闭态的光系统II反应中心贡
献;Y(NPQ)代表的是通过调节性的光保护机制耗散为热的能量(KlughammerandSchreiber,2008)。在强光
下当Y(H)接近于零时,若Y(NPQ)较高,说明藻细胞具有较高的光保护能力;若Y(NO)较高,说明藻细胞
失去了在过剩光下自我保护的能力。在给定的环境条件下,最理想的调节机制是通过保持尽量大的
Y(NPQ)/Y(NO)比值,来获得尽量大的Y(H)。
需要额外指出的是,这种方法同样适用于光系统I的P700差示吸收测量。为此,Schreiber和Klughammer
提出了光系统I的三个参数(SchreiberandKlughammer,2008):Y(I),光系统I光化学能量转换的量子产量;
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第四章叶绿素荧光技术应用
Y(ND),光系统I由于供体侧限制引起的非光化学能量耗散的量子产量;Y(NA),光系统I由于受体侧限制
引起的非光化学能量耗散的量子产量;且Y⑴+Y(ND)+Y(NA)=1。由于这三个参数不属于叶绿素荧光测量
范畴,本文将不展开描述,但将示意图(图5)和计算公式(表1)放在这儿,以供读者在使用时参考。
通过调制叶绿素荧光技术测量的荧光参数,除了上文提到的光合效率和淬灭系数外,还有一个参数也
是使用非常广泛的。它就是光系统II的相对电子传递速率rETR(II)=PAR-Y(II).ETR-factor(Gentyetal.,
1989;Schreiberetal.,1994),其中ETR-factor是指光系统II吸收的光能占总入射PAR的比例。在绝大多数
已发表的文献中,均没有试图去测定ETR-factor,只是简单地假定跟“模式叶片”相同,即有50%的PAR
分配到光系统H,84%的PAR被光合色素吸收(BjbrkmanandDemmig,1987)。因此在已有的文献中,rETR
一般是用公式rETR(II)=PAR-Y(II)-0.84-0.5来计算的(Schreiber,2004)。同样的道理,光系统I的相对
电子传递速率rETR(I)=PAR•Y(I)-0.84-0.5。
近期,Schreiber等利用最新研制的多激发波长调制叶绿素荧光仪MULTI-COLOR-PAM,实现了光系
统II的绝对电子传递速率ETR(II)x的测量(Schreiberetal.,2011;Schreiberetal.,2012)。首先需要利用
MULTI-COLOR-PAM测定某个波长下的光系统II功能性光学截面积Sigma(II);.(单位nm?)(其中X为波
长)(详细测量方法见第六章第五节),然后求出光系统II的量子吸收速率PAR(II)=Sigma(II)z-L-
PAR=0.6022-Sigma(II)x-PAR。其中L为阿伏伽德罗常数,系数0.6022是将1gmolquantam-2(即6.022x
1017quantam。)转换为0.6022quantanm2,PAR(II)的单位为quanta/(PSII•s),接下来就可以计算
ETR(II)x=PAR(II)-Y(n)/Y(II)max,其中Y(II)max是经过暗适应达到稳态后的光系统II的量子产量,也
就是Fv/Fm。ETR(II)的单位为electrons/(PSII-s)»
100%P700
P700A
△战75-【830)
b
>P700A
P700A
.100%P700
SPIf
FRoff
图5利用饱和脉冲技术测量光系统【的能量转换(弓|自SchreiberandKlughammer,2008)
表1列出了文献中使用最广泛的一些用调制叶绿素荧光仪测量的参数,既包括主要的叶绿素荧光(光
系统II)参数,也包括主要的P700(光系统I)参数,同时还列出了常用的快速光曲线拟合参数。
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第四章叶绿素荧光技术应用
表I调制叶绿素荧光仪测量的常用参数
参数简写计算公式生物学意义和其它叫法参数来源文献
光系统II的最大光合效率Fv/Fm(Fm-Fo)/Fm光系统II的最大光能转换效率、最大量子产量(KitajimaandButler.1975)
光系统II的实际光合效率Y(II),AF/Fm\Opsn,<D„(Fm,-F)/Fm,光系统II的实际光能转换效率、实际量子产量(Gentyetal.,1989)
光系统I的实际光合效率Y(I)(Pm'-P)/(Pm-Po)光系统I的实际光能转换效率、实际量子产量(KlughammerandSchreiber,1994;Schreiberand
Klughammer,2008)
光化学淬灭qPl-(F-Fo,)/(Fm,-Fo,)光系统II吸收的能量用于进行光化学反应的比例,开放态的光系统II(Schreiberetal.,1986;vanKootenandSnel,1990)
qL(Fm'-F)/(Fm'-Fo')Fo7F反应中心所占的比例,反应了光合活性的高低(Krameretal.,2004)
非光化学淬灭qNl・(Fm'・Fo')/(Fm-Fo)光系统II吸收的能量用于耗散为热量的比例,也就是植物耗散过剩光(Schreiberetal..1986:vanKootenandSnel.1990)
NPQFm/Fm'-l能为热量的能力,即光保护能力(BilgerandBjorkman.1990)
QA的还原状态1-qP(F-Fo,)/(Fm,-Fo,)QA的还原状态,关闭态的光系统II反应中心所占的比例(BilgerandSchreiber,1986)
光系统11调节性能量耗散的量Y(NPQ),eNPQF/Fm'-F/Fm光系统II吸收的激发能,通过调节性的光保护机制耗散为热的那部分能(CaillyetaL.1996;Gentyetal.,1996;Klughammerand
子产量於Schreiber,2008)
l-Y(II)-1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-l))(Krameretal..2004)
光系统II非调节性能量耗散的Y(NO),ONOF/Fm光系统II吸收的激发能,被动的耗散为热量和发出荧光的那部分能(CaillyetaL,1996;Gentyetal.,1996;Klughammerand
量子产量量,主要由关闭态的光系统II反应中心贡献Schreiber.2008)
l/(NPQ+l+qL(Fm/Fo-l))(Krameretal.,2004)
光系统I由于供体侧限制引起的Y(ND)(P-Po)/(Pm-Po)光系统I由于供体侧限制引起的非光化学能量耗散的量子产量(SchreiberandKlughammer.2008)
非光化学能量耗散的量子产量
光系统I由于受体侧限制引起的Y(NA)(Pm-Pm')Z(Pm-Po)光系统I由于受体侧限制引起的非光化学能量耗散的量子产量(SchreiberandKlughammer,2008)
非光化学能量耗散的量子产量
光系统II的相对电子传递速率rETR(II),ETR(II),ETR,PAR•Y(II)-0.84♦0.5经过光系统II的相对线性电子流速率(Gentyetal..1989;Schreiberetal..1994)
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