基因工程基本技术

基因工程的基本技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术第一节凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脱水—L—半乳糖结合的链状多糖

原理

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳影响电泳迁移速率的四大因素：1.电泳样品的物理性质影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质：包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构。一般来说颗粒带电荷的密度愈大，泳动速率愈快；颗粒物理形状愈大，与支持物的摩擦力越大，泳动速率越小。即泳动率与颗粒的分子大小、介质粘度成反比；与颗粒所带电荷成正比。

1）电荷效应DNA分子在凝胶介质中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

2)分子筛效应具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。质粒DNA样品用单一切点的酶切后与已知相对分子质量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的相对分子质量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。

表琼脂糖浓度与DNA分离范围

3）构型

在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋(SC)的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环状(0C)分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状(L)分子。这3种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型分子迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA时，在凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。

不同构像质粒2.支持物介质DNA的凝胶电泳常使用两种支持材料：琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。通过这两种介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，分离不同分子量的核酸片断。琼脂糖的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断；聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5-50bp）的核酸。3.电场强度电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。电场强度愈大，带电颗粒的泳动率愈快，但凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。在低电压时，线性DNA分子的泳动率与电压成正比。一般凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm。4.缓冲液离子强度缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、pH值、离子浓度直接影响电泳的效率。常用TAE、TBE、TPE三种缓冲体系。缓冲液的pH值直接影响DNA解离程度和电荷密度，缓冲液pH值与核酸样品的等电点相距越远，样品所携带电荷量越多，泳动速度越快。核酸电泳缓冲液，常采用偏碱性或中性条件，使核酸分子带负电荷，向正极泳动。缓冲液的离子强度与样品泳动速度呈反比，电泳的最适离子强度一般在0.02-0.2之间。琼脂糖凝胶电泳的操作过程步骤⑴1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并摇匀。）⑵用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固⑶充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。(4)用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。⑸打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。⑹将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。实验步骤紫外线光源灵敏度:302nm>254nm>366nm结果与分析

图2

PCR产物琼脂凝胶电泳图

(1、2、3、4为PCR产物，M为DL2000Marker)琼脂糖凝胶电泳装置实验步骤制胶90℃以上熔化，凝胶温度35-43℃EB1231、孔深2、预留尺寸3、梳子宽度1+2=胶的厚度3-+加缓冲液拔梳子最好在电泳槽中-+点样-+电泳紫外﹢﹣脉冲电场（PFGE）解决大分子DNA电泳问题第二节核酸分子杂交基本原理具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。杂交有固一液相杂交和液相杂交。变性复性

DNA-DNA杂交双链分子Blotting定义：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程

Legend:SouthernBlotPartI:GelelectrophoresisfollowedbytransfertoamembraneDNACleavedwitharestrictionenzymeSmearofrestrictionfragmentsSouthernBlotPartII:HgybridizationofDNAonmembranetospecificprobeDNAstainedwithethidiumbromideautoradiographofhybridizedmembraneSouthernBlotNorthernBlotprobedwithb-globinUndifferentiatedcells+differentiationfactorNote:MakenorthernjustlikeaSouthern,exceptrunoutRNAsamplesratherthanDNAMeasuresthesteady-statelevelofmRNAtranscriptfromagivengeneSmearofRNAtranscriptsMakingaprobe一个理想的标记物：1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同;2）特异性强、本底低、重复性好；3）操作简单、节时；4）安全、无环境污染。1、标记的种类同位素：

32P、35S、3H、125I等标记探针非同位素：生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物

两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。探针的标记方法缺口平移法随机引物标记法末端标记法生物素光照标记法缺口平移法的原理

将DNAaseI的水解活性与大肠杆菌DNApolymeraseI的5`→3`的聚合酶活性和5`→3`的外切酶活性相结合。首先用DNAaseI在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。

这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。

随机引物标记法原理

用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`-OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。末端标记法原理（1）一种是在5`末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP。生物素光照标记法光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA探针。Westernblot实验技术

WesternBlot基本原理

在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。WesternBlot一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。

细胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的制备蛋白样品的定量Bradford法

考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。(上样量)试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml,3.5mg/ml,3.0mg/ml,2.5mg/ml,2.0mg/ml,1.5mg/ml,1.0mg/ml,0.5mg/ml。）管号012345678ddH2O807070707070707070蛋白标准液01010101010101010样品101010101010101010HCL101010101010101010SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：

SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之SDS後,由於SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺

SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212转膜膜的选择尼龙膜硝酸纤维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格便宜特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：480µg/cm2

；硝酸纤维素膜：80µg/cm2

）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度转膜半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。

转膜后检测丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。封闭脱脂奶粉（5％）BSA（牛血清白蛋白）WesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）一抗、二抗孵育把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4℃过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，37℃一小时，4℃过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP)WesternBlot常见问题分析SDS电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温背景太高膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高

原因对策转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的工作浓度UsingantibodiestodetectacloneSouthern,Northern,andWesternanalyses

细菌转化转染技术●

受体细胞(receptorcell)

又称为宿主细胞或寄主细胞(hostcell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞;从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。

●

感受态(competence)

细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。●

感受态细胞(competencecell)

处于能够吸收DNA状态的细胞。●

细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。●转化子(transformant)：经转化获得外源遗传物质的细胞。●转化(transformation):指将质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。●

转染(transfection):指病毒及其重组子导入受体细胞的过程。●

转导(transduction):指噬菌体及其重组子导入受体细胞的过程。利用物理方法导入、转化

1.质粒的Ca2+诱导转化(E.coli)2.质粒的原生质体转化

3.质粒的高压电穿孔法转化

4.显微注射法转化利用生物方法导入、转染1.细胞噬菌体DNA的转染2.动物病毒DNA的转染3.植物病毒DNA的转染利用生物方法导入、转染1.细胞噬菌体DNA的转染2.动物病毒DNA的转染3.植物病毒DNA的转染（一）氯化钙法●

1970年M.Mandel和A.Hige发现,大肠杆菌经过氯化钙适当处理及短暂热休克之后,便能吸收λ噬菌体DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道,经氯化钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。●

原理是：细菌处于0℃和低渗氯化钙溶液中，菌细胞壁和膜通透性增加,菌体膨胀成球形，此时转化混合物中DNA形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面,经短暂热休克(42℃)后，细胞膜形成许多间隙，DNA进入细胞内。●

如果感受态细胞做得好，每微克超螺旋质粒DNA可得5×107～1×109个转化子。

获得合格的感受态细胞，要注意以下几点：

1、用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在A600为0.4左右为好。

2、制备受体细胞的整个过程在0～4℃进行,尽量避免污染。如果用抗生素筛选转化子，作为对照受体菌应该在此培养基上不生长。

3、为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液，如FSB溶液。

（二）电穿孔法电穿孔法(electroporation):是指在一个较大的电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双层，从而允许DNA等分子通过细胞膜进入细胞，而后细胞膜快速复原，保持细胞的完整。这种方法称为电穿孔法。每μgDNA可以得到109～1010转化子。当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50%～70%细菌死亡，转化水平达到最高。TransformingE.coliwithrecombinantDNAGrowthofBacteriaGeneTransferviabiolistics(“genegun”)ParticlebombardmentBiolisticGunUbiquitinpromoterwhichismonocotspecificcontrollingabacterialreportergene,gusA,intransgenicrice.ParticlebombardmentBiolisticGunBiolisticbombardment(genegun)Transformationof AgrobacteriumClonedGeneinVectorDNAMoleculeProtoplasttransformationfollowedbycellwallregenerationAgrobacterium-mediatedtransformationofplantcellMigrationandintegrationofgeneintonucleusPlantcellsgrownintissuecultureRegenerationofgeneticallymodifiedplantfromtissuecultureGenetictransformationtechnologygermlinetransformationrelieson“totipotency”Plants-morecellshavetotipotency,buttheyalsohaveacellwallAgrobacteriumprotoplast-mediatedmicroprojectilebombardmentAnimals-gettingthegenesiniseasier,buttotipotencyisaproblemviralvectorsmicro-injectionMicroinjectiontechniqueMicroinjectiontechnology

microinjectionintothenucleusofafertilizedzygotecellsneedtobeimmobilisedcellwallsaredetrimentaltotheprocess(protoplastspreferred)damagetothecellmustbeavoidedamethodologyforregenerationofawholeorganismisrequiredplants-protoplastculture(invitro)animals-embryoimplantationprocedure(invivo)Problemscelldamage,lowsuccessratelabourintensiveexpensiveequipmentexpensivewholeanimalfacilitiesPCR技术及其应用

目录PCR的概念PCR技术的创建PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用

多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:

DNA聚合酶

基因组DNA引物DNA聚合酶DNA片段体外扩增（一）PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……（一）PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryB.Mullis（1944－）（一）PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长（一）PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物（一）PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段限制性内切酶裂解基因组DNA基因重组转化细菌体外包装基因组DNA文库DNA文库20kBfragments插入噬菌体载体细菌扩增裂解变性显影从基因组文库中筛选目的基因probe放射性核素标记转印DNA克隆目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子DNA聚合酶引物引物M13噬菌体Sanger的测序技术引物DNA聚合酶1977年引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术72℃94℃55℃PCR循环PCR技术的原理1PCR技术的基本原理

无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。

体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类引物复习5’3’加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。

PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火2PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2）特异性引物引物

引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子4）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。

总体积50-100lBuffer

缓冲液

dNTP原料

Primer引物

DNA分子模板

Taq酶DNA聚合酶

1反应体系PCR技术的基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本过程PCR技术的基本过程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循环25～35次琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3PCR反应条件（2）引物浓度

0.1-0.5mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数变性

使双链DNA解链为单链

94oC20-30秒(2)退火

温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸

70-75℃,一般为72℃

延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加经典循环参数（500bp以内）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever1）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针

基因组DNA结构功能的研究

PCR的类型

高浓度引物低浓度引物2)反向PCR(reversePCR)

是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶3）多重PCR（复合PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物12341234DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4标记引物ＰＣＲ观察PCR产物5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列

对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？（固定化PCR）cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号可用于基因芯片的制作7）原位ＰＣＲ

原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列

原位PCR的作用

既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。

ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达8）ＲＴ－ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增

RT－PCR:是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应,用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。基因mRNA蛋白质多肽链9)荧光定量PCR（real-timePCR)

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。荧光定量PCR仪光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。荧光标记荧光定量PCR标记方法内掺式染料

SYBRGreenI序列特异性探针 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

Taqman探针3′端Q荧光分子能够吸收5′端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5′端荧光分子发出的荧光