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文档简介
高效液相色谱简介(HPLC)是以气相色谱为基础,在经典液相色谱实验和技术基础上,采用颗粒十分细的固定相,并采用高压泵输送流动相而建立的一种液相色谱法。HPLC的突出特点:
1)高压;2)高速;3)高效;
4)高灵敏度(10-9);
5)高选择性;HPLC的应用范围:溶解后能制成溶液的样品,不受样品挥发性和热稳定性的限制,分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测,用途广泛,占有机物的80%。GC与LC的比较HPLC
系统溶剂传输系统:心脏高压泵样品引入系统:自动购置进样器样品分离系统:关键色谱柱信号检测系统:检测器数据处理系统:软件泵的基本原理(高压泵.swf)往复活塞泵(单向阀)弹簧隔板/红宝石球串联柱塞泵消除流量脉冲
并联柱塞泵减小流量脉冲
仪器:手动进样器-六通阀/定量环(LC.swf)六通阀定量环高压定量进样阀:高压力工作状态,通常使用耐高压的六通阀进样装置。优点:进样准确,重现性好,适于定量分析。仪器:自动进样器自动进样100样品盘/机器手/自动洗针机械手样品盘色谱柱:柱温箱、色谱柱外挂架柱温箱外挂架仪器:检测器-紫外UV/Vis双灯,全波长检测DAD检测器流路仪器:检测器-其它仪器:化学工作站进样器高压泵流动相色谱柱检测器数据处理流动相HPLC流动相除了起运载作用外,还直接参与分离,影响明显。盐的影响:通常加入醋酸盐、硼酸盐、硫酸盐等。无机盐使流动相表面张力增大,对非离子性溶质,使k增加,对离子型溶质,k下降。对碱性有机物有改善峰形的作用。pH值:加入酸、碱或缓冲液,控制PH,抑制溶质的离子化,改善峰形。用于分析弱酸、碱。流动相单组分(一种溶剂)和多组分;极性、弱极性、非极性;固定组成洗脱和梯度洗脱;用二元或三元组合溶剂灵活调节流动相的极性或增加选择性,改进分离或调整出峰时间。无水正庚烷含水正庚烷水饱和正庚烷色谱柱C18流动相常用作流动相的溶剂有:乙腈、甲醇、乙腈–
水、甲醇-水、四氢呋喃、氯仿、正己烷等。乙腈的毒性、成本均高于甲醇,在等度淋洗时一般选用甲醇-水体系。乙腈-水比较适合梯度洗脱,而甲醇-水系统出于热力学和可压缩性因素,在梯度洗脱时易导致基线漂移。梯度洗提(脱)梯度洗脱即程序控制流动相的组成,使在整个分离过程中,溶剂强度按照特定的变化规律增加。优点:分离复杂混合物,使所有组分都处在最佳的k值范围内。缺点:检测器的使用受到限制,分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。与气相色谱中的程序升温相当对于亲水性固定液,采用疏水性流动相,即流动相的极性小于固定液的极性(正相
normalphase色谱),反之,流动相的极性大于固定液的极性(反相
reversephase色谱)。为什么?化学键合相色谱优点:有较好的分离效果;缺点:固定液流失,使柱效和分离选择性下降产生基线噪声而降低检测器的灵敏度。不适用于梯度洗脱操作。***化学键合相色谱法***为了解决固定液的流失问题,人们将各种不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶(载体)表面的游离羟基上,而生成化学键合固定相,并进而发展成键合相色谱法。特点:化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的色谱柱柱效高、使用寿命长、重现性好,几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性,特别适用于具有宽范围k值的样品的分离,并可用于梯度洗脱操作。根据键合固定相与流动相相对极性的强弱,该法分为正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。在前者中,键合固定相的极性大于流动相的极性,适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物。在后者中,键合固定相的极性小于流动相的极性,适于分离非极性、极性或离子型化合物。据统计在高效液相色谱法中,约70%——80%的分析任务皆由反相键合相色谱法来完成的。反相HPLC极性:固定相<流动相固定相-非极性流动相(甲醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-极性非极性物质后出峰正相HPLC 极性:固定相>流动相固定相-极性流动相(己烷,庚烷)-非极性极性物质后出峰正相色谱20%反相色谱80%正相色谱20%反相色谱80%正己烷/异丙醇(v/v):70/30;80/20;90/10;95/5正相HPLC为什么反相色谱应用如此广泛?它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。选择性可通过用缓冲溶液进行调节(通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等),以实现最佳分离。固定相-填充材料液相色谱柱填料尽管有有机高分子、石墨化碳、氧化铝、氧化钛,氧化锆等,但多以全多孔硅胶作基质。烷基键合固定相特性对保留值的影响:反相:键合相烷链长,k大,选择性好。现代高效液相色谱柱的要求超纯B型球形硅胶——峰形好、柱效高。不能有使色谱性能降低的直径小于50Å的微孔。粒径尺寸从3µm到10µm——能满足从分析到制备色谱规模的需求。色谱柱柱床装填好——使用寿命长、柱效高。封尾彻底——峰形好、使用寿命长。批与批之间得重现性好。不同的相具有不同的选择性——能更好的实现分离。键合相化学稳定好——适用的pH范围广,使用寿命长。HPLC色谱柱结构类型内径D(cm)柱长(cm)粒径(µm)分析柱0.3–0.463-253-10微孔柱0.1,0.2115,253-8半制备柱0.8–1.010-255-20制备柱2.0–5.010-255-20HPLC在医药方面的应用1、新药研发:目标物的检测、纯度等
2、药品的预处理:片剂,油膏,水剂等
3、体液:血、尿、脊椎液、唾液等
4、抗菌素:青霉素、甾族(激素)等
5、其它……HPLC在环保方面的应用1、农药残留量分析:含氯农药、有机磷
农药、除虫菊等
2、致癌物质:硝基呋喃及其代谢物、霉
素、亚硝胺、苯并芘等
3、水质分析:内分泌污染物等
4、其它……
HPLC在生化方面的应用1、蛋白质分析
2、肽类的分析
3、核酸
4、氨基酸
5、其它……
手性的普遍性及在医药中的重要性手性的发现和普遍存在Pasteur(1848年外消旋酒石酸钠铵盐晶体)实物与镜像不重合蛋白质、核酸等手性化合物的性质
(旋光、手性环境)反应停事件(20世纪六十年代)1956年,联邦德国格仑南苏药厂开始出售一种名为“反应停”(酞胺哌啶酮)的药物,用于治疗妊娠呕吐反应,并有镇静、安眠作用。(17个国家)
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