朱明华版仪器分析HPLC

高效液相色谱简介（HPLC）是以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上，采用颗粒十分细的固定相，并采用高压泵输送流动相而建立的一种液相色谱法。HPLC的突出特点：

1）高压;2）高速;3）高效;

4）高灵敏度(10-9);

5）高选择性;HPLC的应用范围：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制，分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80%。GC与LC的比较HPLC

系统溶剂传输系统：心脏高压泵样品引入系统：自动购置进样器样品分离系统：关键色谱柱信号检测系统：检测器数据处理系统：软件泵的基本原理（高压泵.swf）往复活塞泵(单向阀)弹簧隔板/红宝石球串联柱塞泵消除流量脉冲

并联柱塞泵减小流量脉冲

仪器：手动进样器-六通阀/定量环（LC.swf）六通阀定量环高压定量进样阀：高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。优点：进样准确，重现性好，适于定量分析。仪器：自动进样器自动进样100样品盘/机器手/自动洗针机械手样品盘色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架柱温箱外挂架仪器：检测器-紫外UV/Vis双灯，全波长检测ＤＡＤ检测器流路仪器：检测器-其它仪器：化学工作站进样器高压泵流动相色谱柱检测器数据处理流动相HPLC流动相除了起运载作用外，还直接参与分离，影响明显。盐的影响：通常加入醋酸盐、硼酸盐、硫酸盐等。无机盐使流动相表面张力增大，对非离子性溶质，使k增加，对离子型溶质，k下降。对碱性有机物有改善峰形的作用。pH值：加入酸、碱或缓冲液，控制PH，抑制溶质的离子化，改善峰形。用于分析弱酸、碱。流动相单组分（一种溶剂）和多组分；极性、弱极性、非极性；固定组成洗脱和梯度洗脱；用二元或三元组合溶剂灵活调节流动相的极性或增加选择性，改进分离或调整出峰时间。无水正庚烷含水正庚烷水饱和正庚烷色谱柱C18流动相常用作流动相的溶剂有：乙腈、甲醇、乙腈–

水、甲醇-水、四氢呋喃、氯仿、正己烷等。乙腈的毒性、成本均高于甲醇，在等度淋洗时一般选用甲醇-水体系。乙腈-水比较适合梯度洗脱，而甲醇-水系统出于热力学和可压缩性因素，在梯度洗脱时易导致基线漂移。梯度洗提(脱)梯度洗脱即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂强度按照特定的变化规律增加。优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。与气相色谱中的程序升温相当对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相

normalphase色谱），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相

reversephase色谱）。为什么？化学键合相色谱优点：有较好的分离效果；缺点：固定液流失，使柱效和分离选择性下降产生基线噪声而降低检测器的灵敏度。不适用于梯度洗脱操作。***化学键合相色谱法***为了解决固定液的流失问题，人们将各种不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶(载体)表面的游离羟基上，而生成化学键合固定相，并进而发展成键合相色谱法。特点：化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的色谱柱柱效高、使用寿命长、重现性好，几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性，特别适用于具有宽范围k值的样品的分离，并可用于梯度洗脱操作。根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，该法分为正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。在前者中，键合固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物。在后者中，键合固定相的极性小于流动相的极性，适于分离非极性、极性或离子型化合物。据统计在高效液相色谱法中，约70％——80％的分析任务皆由反相键合相色谱法来完成的。反相HPLC极性:固定相<流动相固定相-非极性流动相(甲醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-极性非极性物质后出峰正相HPLC 极性:固定相>流动相固定相-极性流动相(己烷,庚烷)-非极性极性物质后出峰正相色谱20%反相色谱80%正相色谱20%反相色谱80%正己烷/异丙醇（v/v）：70/30；80/20；90/10；95/5正相HPLC为什么反相色谱应用如此广泛?它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。固定相-填充材料液相色谱柱填料尽管有有机高分子、石墨化碳、氧化铝、氧化钛，氧化锆等，但多以全多孔硅胶作基质。烷基键合固定相特性对保留值的影响：反相：键合相烷链长，k大，选择性好。现代高效液相色谱柱的要求超纯B型球形硅胶——峰形好、柱效高。不能有使色谱性能降低的直径小于50Å的微孔。粒径尺寸从3µm到10µm——能满足从分析到制备色谱规模的需求。色谱柱柱床装填好——使用寿命长、柱效高。封尾彻底——峰形好、使用寿命长。批与批之间得重现性好。不同的相具有不同的选择性——能更好的实现分离。键合相化学稳定好——适用的pH范围广,使用寿命长。HPLC色谱柱结构类型内径D(cm)柱长(cm)粒径(µm)分析柱0.3–0.463-253-10微孔柱0.1,0.2115,253-8半制备柱0.8–1.010-255-20制备柱2.0–5.010-255-20HPLC在医药方面的应用1、新药研发：目标物的检测、纯度等

2、药品的预处理：片剂，油膏，水剂等

3、体液：血、尿、脊椎液、唾液等

4、抗菌素：青霉素、甾族(激素)等

5、其它……HPLC在环保方面的应用1、农药残留量分析：含氯农药、有机磷

农药、除虫菊等

2、致癌物质：硝基呋喃及其代谢物、霉

素、亚硝胺、苯并芘等

3、水质分析：内分泌污染物等

4、其它……

HPLC在生化方面的应用1、蛋白质分析

2、肽类的分析

3、核酸

4、氨基酸

5、其它……

手性的普遍性及在医药中的重要性手性的发现和普遍存在Pasteur（1848年外消旋酒石酸钠铵盐晶体）实物与镜像不重合蛋白质、核酸等手性化合物的性质

(旋光、手性环境)反应停事件（20世纪六十年代）1956年，联邦德国格仑南苏药厂开始出售一种名为“反应停”（酞胺哌啶酮）的药物，用于治疗妊娠呕吐反应，并有镇静、安眠作用。（17个国家）