微生物限度检查操作规程中国药典四部通则

标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第1页起草人审核人批准人起草日期审核日期批准日期起草部门质量管理部颁发部门办公室生效日期一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作规定；合用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。二、引用标准：《中国药典》2023年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用品3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8.附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准需氧菌总数(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌总数(cfu/g或cfu/ml)控制菌药用原料及辅料103102**未做统一规定。1.1成品微生物限度标准品名法定标准内控标准需氧菌总数(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌总数(cfu/g或cfu/ml)控制菌需氧菌总数(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌总数(cfu/g或cfu/ml)控制菌大肠埃希菌沙门菌大肠埃希菌沙门菌乳糖≤1000≤100—无≤100≤50——无水乳糖≤100≤10—/10g—/100g≤100≤10—/10g—/100g蔗糖无无无无≤100≤50——(1)．“—”为不得检出。(2)．目测霉变者以不合格论。(3)．“无”为标准依据或无相应规定。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第2页1.2工艺用水微生物限度标准品名法定标准内控标准需氧菌总数(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）需氧菌总数(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）生活饮用水≤100不得检出≤100不得检出纯化水≤lOO不得检出≤80不得检出1.3内包装材料微生物限度标准品名(单位)需氧菌总数霉菌和酵母菌总数控制菌需氧菌总数霉菌和酵母菌总数控制菌药用聚乙烯烃塑料袋(100cm2)≤1000cfu≤100cfu—≤100cfu≤10cfu—说明： 1．“—”为每100cm2中不得检出。2．目测霉变者以不合格论。3．“无”为标准依据或无相应规定。2．设施、仪器及用品2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数实验环境应符合微生物限度检查的规定。检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。生化试剂储存箱。2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9cm）、量筒（100ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。2.3用过的玻璃器皿：2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第3页2.3.2已被病原微生物污染的器皿：需先通过灭菌解决后再按常法洗涤。试管及培养皿：先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经121℃灭菌30分钟。趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。吸管：所有直立浸没于清洁液的长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。24小时后，逐支用流水反复冲洗洁净，晾干后包扎灭菌备用。载、盖玻片：应分别浸泡于清洁液12~24小时后，取出用流水冲洗，再放入3%~5%肥皂水或5%碳酸钠液内煮沸10~15分钟，待自然冷却后，再用流水冲洗。沥干后置95%乙醇中浸泡，晾干备用。2，3，3玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污染瓶塞），再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽121℃灭菌30分钟，烘干备用。2.4用品2.4.1大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%~75%乙醇溶液浸泡）。2.4.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。2.4.3接种环（白铱金或镍铬合金，环径4~5mm、长度6~10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。3消毒液、稀释剂、试液及培养基3.1消毒液、稀释剂及试液。3.1.10.1%苯扎溴铵溶液：供洗手、擦拭操作台面用。3.1.25%石碳酸溶液：配制后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用，抑或选用其他适宜消毒液。3.1.3．75%乙醇溶液：配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。3.1.4．0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。3.1.5．司盘-80、单硬脂酸甘油酯、吐温-80：供非水溶性供试品供试液制备用。3.1.6．无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）：取氯化三苯四氮唑0.1g，加水使溶解成10ml。3.1.7．甲基红指示液：取甲基红0.1g，加入95%乙醇300ml，水适量，使溶解，再加水至500ml。3.1.8．V-P试液：①氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100ml；②α-萘酚乙醇试液：取α-萘酚6.0g，加无水乙醇使溶解成100ml。3.1.9．革兰染色液：①沙黄染液：取沙黄0.25g，加95%的乙醇10ml，使完全溶解后，加水至100ml；②结晶紫染液：取结晶紫1.0g，加95%的乙醇20ml，使溶解，加1%的草酸铵溶液80ml，混匀。静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存；③碘试液：取碘化钾2.0g，加水3~5ml使溶解，加入碘片1.0g，使所有溶解后，加水稀释至300ml，置密标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第4页闭棕色瓶中储存。3.1.10．中性红指示液：取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml，使溶解，再加水到100ml。变色范围pH6.8~8.0（红→黄）。3.1.11．亚甲蓝指示液：取亚甲蓝0.5g，加水使溶解成100ml。3.1.12．溴麝香草酚蓝指示液：取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。变色范围pH6.0~7.6（黄→蓝）。3.1.13．酸性品红指示液：以酸性品红0.5g，加水100ml使溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴均应将溶液充足摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。优点：无色，在倒管内初期发酵易观测，不易被还原。变色范围pH6.0~7.4（红→黄）。3.1.14．曙红钠指示液：取曙红钠2.0g，加水使溶解成100ml。3.1.15．靛基质试液：取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充足振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml渐渐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。3.2培养基3.2.1．培养基的制备及储存3,2,1,1溶化：一般应放在玻璃器皿或搪瓷器内。加入纯化水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分。3.2.1.2在使用干燥培养基时，先将纯化水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置10~15分钟，搅拌，振荡，或延长时间以促进溶解，一般不要加热，必要时加热，但时间不宜过长，温度不宜过高，避免某些营养成分被破坏。3.2.1.3校正酸碱度：培养基必须有适当的pH值。测定pH值是培养基配制过程中的重要环节之一，干燥培养基一般已校正过pH值，用时也必须再验证。pH值测定期，一般用指示剂滴入培养基中观测其颜色的变化，或用pH计校正，如与所需pH值不符，可用酸或碱液加以校正。一般用氢氧化钠校正的弱碱性培养基，高压灭菌前培养基的pH值高0.2左右，灭菌后基本合适。调整pH值后要加热过滤，使培养基澄清。3.2.2培养基的分装：3.2.2.1液体、半固体培养基一般在高压灭菌前分装，约装试管容积的1/3，在灭菌后还要加入成分的液体、半固体培养基，灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。3.2.2.2固体培养基一般分装在250ml、500ml锥形瓶中，高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。平皿：如倾注平皿，应在无菌室中放置3～4小时，如用塑料平皿须在35℃培养箱中倒置30～60分钟。水蒸气会自然蒸发。斜面：制备低层斜面分装于试管，约占容积的1/5，灭菌后趁热斜放于细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装时注意管口和瓶塞上勿沾有培养基，避免污染。制备高层斜面分装于试管，约占试管容积的1/3，灭菌后趁热放置成高层短斜面，待其凝固后应用。3.2.3培养基的灭菌：培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基的灭菌时间和压力，按其成分不同而定。普通培养基多采用121℃、103.42kPa灭菌15分钟，但容器和装量较大时，可延长至20分钟。高压灭菌应严格按照操作规程进行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内的冷空气，再逐渐升压保持预定的压力和时间，达成全杀灭微生物的目的。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第5页3.2.4培养基的储存：保存培养基的时间需视培养基中水分蒸发的限度及有无污染而定，已制备好培养基要保存于冷暗处或冰箱中，但由于各种培养基的性质不同，不也许固定一个保存期限。制备好的平板或试管培养基，为防止水分蒸发，应置于塑料袋内，4℃保存，可延长使用期限。微量生化反映管熔封于细玻管内，室温下可保存1年左右。3.3注意事项：3.3.1采用干燥培养基时，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以拟定配制时琼脂的用量。试剂规格规定应为化学纯（CP）以上规格，其中不能具有对细菌、霉菌、大肠杆菌生长有害的克制物。3.3.2配制的培养基不应当有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，并应于2小时内灭菌，避免细菌繁殖。3.3.3培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落导致染菌。3.3.4配制培养基的pH值测定期，其波动范围应在规定的pH±0.2之内，还需注意高压灭菌后的pH值变化。3.3.5每批培养基均应有配制记录，涉及名称、配制量（各种成分用量）、配制者、校对者、配制日期以及性能和无菌实验。3.3.6每批培养基在用于样品的分离鉴定之前均应作性能实验，以保证微生物检查的质量。性能实验须用已知标准菌株进行预试，符合规定方可应用。3.3.7棉塞以普通棉花制作，棉塞松紧应适宜，过松易污染杂菌，过紧影响透气性；每次用后需高压灭菌并随即烘干，要防尘、防霉；变硬无弹力时需更换。3.3.8各种试管应先配上合适的棉塞，待高压灭菌后再分装培养基，可防止污染。3.3.9培养基配制时，应先将有沉淀物的原料如蛋白胨、牛肉膏、盐类和琼脂配好，经调节pH值、加热并煮沸溶化后再滤清；滤清时注意趁热过滤，滤除异物、沉淀后，应将蒸发失去的溶液量按原溶液量加纯化水补足。3.3.10应严格遵守各种培养基规定的灭菌温度和时间，灭菌后培养基不得有混浊现象，每瓶配制并灭菌后的培养基、稀释剂均应在外表清楚标明灭菌日期。3.3.11每批稀释剂、培养基均应有空白实验，合格后方能使用。3.3.12灭菌后的培养基在冷暗处保存，放置时间不能过长，一般在两周内用完。久存培养基失水过多、固体干涸变形、液体出现沉淀、棉塞松弛或脱落者均不得使用。已熔化的培养基应一次用完，启动后不宜再用。3.3.13勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度受热而破坏，应用水浴或微波炉加热。4.检查总则（1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）4.1微生物计数法合用范围：系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检查，涉及样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不合用于活菌制剂的检査。如供试品有抗菌活性，应尽也许去除或中和。供试品检査时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。供试液制备时假如使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第6页4.2微生物计数法4.2.1合用性实验用菌株(表1)实验菌株实验菌液的制备计数培养基合用性检查计数方法合用性实验需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CCMCC(B)26003〕胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30〜35C，培养时间18〜24小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35℃培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度30-35℃,培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CCMCC(B)10104胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35℃，培养时间18〜24小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35℃培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度30-35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu枯草芽孢杆菌{.Bacillussubtilis)〔CMCC(B)63501〕胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35℃培养时间18-24小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35℃培养时间不超过3天，接种量不大于lOOcfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度30-35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于lOOcfu白色念珠菌(Candidaalbicans)CCMCC(F)98001〕沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20-25℃培养时间2-3天胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30-35℃培养时间不超过5天，接种量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20-25℃培养时间不超过5天，接种量不大于lOOcfu胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不合用）培养温度30〜35°C，培养时间不超过5天，接种量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20-25℃培养时间不超过5天，接种量不大于lOOcfu标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第7页黑曲霉（Asper君山wsniger)CCMCC(F)98003〕沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度20-25℃培养时间5〜7天，或直到获得丰富的孢子胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30-35℃培养时间不超过5天，接种量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20-25℃培养时间不超过5天，接种量不大于lOOcfu胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不合用）培养温度30-35℃培养时间不超过5天，接种量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20-25℃培养时间不超过5天，接种量不大于lOOcfu注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基合用性检查，检査方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。4.2.2计数方法：涉及平皿法、薄膜过滤法和最也许数法（Most-Probable-NumberMethod,简称MPN法）。MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法也许是更适合的方法。供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的实验结果可以判断供试品是否符合规定。所选方法的合用性须经确认。计数培养基合用性检査和供试品计数方法合用性实验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行合用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法合用性实验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。若检查程序或产品发生变化也许影响检查结果时，计数方法应重新进行合用性实验。4.2.3菌种及菌液制备4.2.3.1菌种实验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证实验菌株的生物学特性。4.2.3.2计数培养基合用性检查和计数方法合用性实验用菌株见（表1）。菌液制备按(表1)规定程序培养各实验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加人3〜5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7_0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2〜8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2〜8℃,在验证过的贮存期内使用。4.2.4阴性对照为确认实验条件是否符合规定，应进行阴性对照实验，阴性对照实验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。4.2.5培养基合用性检査微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基合用性检查。按(表1)规定，接种不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1规定条件下培养。每一实验标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第8页菌株平行制备2管或2个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5〜2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，实验菌应生长良好。4.3计数方法合用性实验4.3.1供试液制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采用适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均勻加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检查用培养基，不得超过1小时。常用的供试液制备方法如下（假如下列供试液制备方法经确认均不合用，应建立其他适宜的方法）4.3.1.1水溶性供试品取供试品，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要，调节供试液pH值至6〜8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。4.3.1.2水不溶性非油脂类供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加人表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80,使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6〜8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。4.3.1.3油脂类供试品取供试品，加人无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充足混勻。表面活性剂的温度一般不超过40t：(特殊情况下，最多不超过45°C)，小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加人预热的稀释液使成1:10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步10倍系列稀释。4.3.1.4需用特殊方法制备供试液的供试品膜剂供试品取供试品，剪碎，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡，振摇，制成1:10的供试液。若需要，调节供试液pH值至6〜8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品，加人PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂），置45℃水浴中，振摇，使溶解，制成1:10的供试液。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。4.3.1.5气雾剂、喷雾剂供试品取供试品，置一20°C或其他适宜温度冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品启动部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓所有释出。供试品亦可采用其他适宜的方法取出。用无菌注射器从每一容器中吸出药液于无菌容器中混合，然后取样检査。4.3.1.6贴剂供试品取供试品，去掉防粘层，将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上，在粘贴面上覆盖一层适宜的无菌多孔材料(如无菌纱布），避免贴膏剂粘贴在一起。将解决后的贴膏剂放入盛有适宜体积并具有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）稀释液的容器中，振荡至少30分钟。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第9页4.3.2.接种和稀释按下列规定进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收实验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充足检出，一方面应选择最低稀释级的供试液进行计数方法合用性实验。4.3.2.1实验组取上述制备好的供试液，加入实验菌液，混勻，使每lml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于lOOcfu。4.3.2.2供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同实验组操作。4.3.2.3菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按实验组操作加人实验菌液并进行微生物回收实验。4.3.2.4若因供试品抗菌活性或溶解性较差的因素导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法合用性实验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的解决。假如供试品对微生物生长的克制作用无法以其他方法消除，供试液可通过中和、稀释或薄膜过滤解决后再加人实验菌悬液进行方法合用性实验。4.4抗菌活性的去除或灭活供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。若实验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌落数值的50%,可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。4.4.1增长稀释液或培养基体积。4.4.2加入适宜的中和剂或灭活剂。中和剂或灭活剂（表2)可用于消除干扰物的抑菌活性，最佳在稀释液或培养基灭菌前加入。若使用中和剂或灭活剂，实验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液替代供试品同实验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5〜2范围内。表2常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛、汞制剂酚类、乙醇、醛类、醛类季铵化合物、对羟基苯甲酸、双胍类化合物季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸水银水银、汞化物、醛类EDTA、唆喏酮类抗生素磺胺类β内酰胺类抗生素亚硫酸氢钠吸附物稀释法甘氨酸卵磷脂聚山梨酯巯基醋酸盐硫代硫酸盐镁或钙离子对氨基苯甲酸β内酰胺酶4.4.3采用薄膜过滤法^4.4.4上述几种方法的联合使用。若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法，对特定实验菌回收的失败，表白供试品对该实验菌具有较强抗菌活性，同时也表白供试品不易被该类微生物污染。但是，供试品也也许仅对特定实验菌株具有克制作用，而对其他菌株没标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第10页有克制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检查结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法合用性实验。若方法合用性实验符合规定，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检査。4.5供试品中微生物的回收表1所列的计数方法合用性实验用的各实验菌应逐个进行微生物回收实验。微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN法。4.5.1平皿法平皿法涉及倾注法和涂布法。表1中每株实验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。倾注法：取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液lml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15〜20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增长。按表1规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各实验组的平均菌落数。涂布法：取15〜20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注人直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。若使用直径较大的平皿，培养基用量也应相应增长。每一平板表面接种上述照“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液不少于0.1ml。按表1规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各实验组的平均菌落数。4.5.2薄膜过滤法薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45pm，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充足干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml。总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液适量（一般取相称于lg、lml或10cm2的供试品，若供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液中，混匀，过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。按表1规定条件培养、计数。每株实验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。4.5.3MPN法MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不合用于霉菌计数。若使用MPN法，按下列环节进行。取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液至少3个连续稀释级，每一稀释级取3份lml分别接种至3管装有9〜10ml胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。接种管置30〜35°C培养3天，逐日观测各管微生物生长情况。假如由于供试品的因素使得结果难以判断，可将该管培养物转种至胰标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第11页酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基，在相同条件下培养1〜2天，观测是否有微生物生长。根据微生物生长的管数从表3查被测供试品每lg或每lml中需氧菌总数的最也许数。表3微生物最也许数检索表生长管数需氧菌总数最也许数95%置信限每管含样品的g或ml数MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000<309.4001309.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.535201144352022053821015438211205382122799422021540221289942223599423029994231369943002359430138910430264161813104391813117517190标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第12页312120303603131603038032093183603211503038032221030400323290909903302409099033146090198033211002004000333>1100注：表内所列检查量如改用lg(或ml)、0.lg(或ml)和O.Olg(或ml)时，表内数字应相应减少10倍；如改用O.Olg(或ml)、O.OOlg(或ml)和O.OOOlg(或ml)时，表内数字应相应增长10倍，其余类推。5.微生物计数法检查5.1计数方法合用性实验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，实验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5〜2范围内；采用MPN法时，实验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内。若各实验菌的回收实验均符合规定，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。方法合用性确认时，若采用上述方法还存在一株或多株实验菌的回收达不到规定，那么选择回收最接近规定的方法和实验条件进行供试品的检査。5.2供试品检查5.2.1检查量：检查量即一次实验所用的供试品量(g、ml或cm2)。一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检查。除另有规定外，一般供试品的检查量为10g或10ml;膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检查量可以酌减。检查时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。5.2.2供试品的检査按计数方法合用性实验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数阴性对照实验以稀释液代替供试液进行阴性对照实验，阴性对照实验应无菌生长，假如阴性对照有菌生长，应进行偏差调査。5.3平皿法平皿法涉及倾注法和涂布法。除另有规定外，取规定量供试品，按方法合用性实验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平板。培养和计数除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30〜35°C培养3〜5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20〜25°C培养5〜7天，观测菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。菌数报告规则需氧菌总数标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第13页测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于lOOcfu的稀释级，作为菌数报告的依据。取最髙的平均菌落数，算lg、lml或10cm2供试品中所含的微生物数，取两位4效数字报告。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。5.4薄膜过滤法除另有规定外，按计数方法合用性实验确认的方法进行供试液制备。取相称于lg、lml或10cm2供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照方法合用性实验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每张滤膜上的菌落数应不超过lOOcfu菌数报告规则以相称于lg、lml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数（每张滤膜过滤lg、lml或10cm2供试品），或<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。5.5MPN法取规定量供试品，按方法合用性实验确认的方法进行供试液制备和供试品接种，所有实验管在30〜35X：培养3〜5天，假如需要确认是否有微生物生长，按方法合用性实验拟定的方法进行。记录每一稀释级微生物生长的管数，从表3査每lg或lml供试品中需氧菌总数的最也许数。5.6结果判断需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数(涉及真菌菌落数霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数(涉及细菌菌落数）。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度规定，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基)进行霉菌和酵母菌总数测定。使用选择性培养基时，应进行培养基合用性检查。若采用MPN法，测定结果为需氧菌总数。各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：lOcfu：可接受的最大菌数为20;102cfu：可接受的最大菌数为200;103cfu：可接受的最大菌数为2023，依此类推。若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检査结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。6．控制菌检查法（非无菌产品微生物限度：控制菌检查法）6.1控制菌检查法系用于在规定的实验条件下，检査供试品中是否存在特定的微生物。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检查，涉及样品取样量和结果判断等^6.1.1供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。6.1.2供试液制备及实验环境规定同“非无菌产品微生物限度6.1.3检查：微生物计数法(通则1105)”。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第14页6.1.4假如供试品具有抗菌活性，应尽也许去除或中和。供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。供试液制备时假如使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。6.2培养基合用性检查和控制菌检查方法6.2.1合用性实验6.2.1.1供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行合用性检査。6.2.1.2供试品的控制菌检查方法应进行方法合用性实验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。6.2.1.3若检查程序或产品发生变化也许影响检查结果时，控制菌检查方法应重新进行合用性实验。6.2.2菌种及菌液制备菌种实验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证实验菌株的生物学特性。金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)CCMCC(B)26003〕铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)￡CMCC(B)10104〕大肠埃希菌(EsdieWchacoa)CCMCC(B)44102〕乙型副伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB)CCMCC(B)50094〕白色念珠菌（canidiaAlbicans)CCMCC(F)98001〕生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）CCMCC(B)64941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30〜35°C培养18〜24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20〜25°C培养2〜3天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30〜35°C培养24〜48小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30〜35°C培养18〜24小时。上述培养物用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2〜8°C，可在24小时内使用。生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，孢子悬液可保存在2〜8*C，在验证过的贮存期内使用。6.2.3阴性对照为确认实验条件是否符合规定，应进行阴性对照实验，阴性对照实验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。6.2.4培养基合用性检查6.2.4.1控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的合用性检查。控制菌检査用培养基的合用性检查项目涉及促生长能力、克制能力及指示特性的检查。各培养基的检查项目及所用的菌株见表1。6.2.4.2液体培养基促生长能力检査分别接种不大于lOOcfu的实验菌(表1)于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管实验菌应生长良好。6.2.4.3固体培养基促生长能力检査用涂布法分别接种不大于lOOcfu的实验菌（表1)于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检査规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特性应一致。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第15页表1控制菌检査用培养基的促生长能力、克制能力和指示特性控制菌检査培养基特性实验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌液体培养基紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基促生长能力克制能力促生长能力+指示特性大肠埃希菌、铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌大肠埃希菌麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基促生长能力克制能力促生长能力+指乐特性大肠埃希菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌沙门菌RV沙门菌增菌液体培养基木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基三糖铁琼脂培养基促生长能力克制能力促生长能力+指示特性指示能力乙型副伤寒沙门菌金黄色葡萄球菌乙型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌铜绿假单胞菌溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基促生长能力克制能力铜绿假单胞菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌甘露醇氯化钠琼脂培养基促生长能力+指示特性克制能力金黄色葡萄球菌大肠埃希菌梭菌梭菌增菌培养基哥伦比亚琼脂培养基促生长能力促生长能力生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基念珠菌显色培养基促生长能力促生长能力+指示特性促生长能力+指示能力克制能力白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌大肠埃希菌培养基克制能力检査接种不少于lOOcfu的实验菌（表1)于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检査规定的培养温度及不小于规定的最长培养时间下培养，实验菌应不得生长。培养基指示特性检査用涂布法分别接种不大于lOOcfu的实验菌（表1)于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上实验菌生长的菌落大小、形态特性、指示剂反映情况等应与对照培养基一致。6.3控制菌检壷方法合用性实验6.3.1供试液制备按下列“供试品检査”中的规定制备供试液。实验菌根据各品种项下标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第16页微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应实验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时，采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为实验菌。合用性试狳按控制菌检査法取规定量供试液及不大于lOOcfu的实验菌接人规定的培养基中；采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加人实验菌，过滤后，注人规定的培养基或取出滤膜接人规定的培养基中。依相应的控制菌检査方法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加实验菌相应的反映特性。结果判断上述实验若检出实验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出实验菌，应消除供试品的抑菌活性[见非无菌产品微生物检査：微生物计数法(通则1105)中的“抗菌活性的去除或灭活”]，并重新进行方法合用性实验。6.3.2假如通过实验确证供试品对实验菌的抗菌作用无法消除，可认为受克制的微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。6.4供试品检査：供试品的控制菌检查应按经方法合用性实验确认的方法进行。6.5阳性对照实验阳性对照实验：方法同供试品的控制菌检查，对照菌的加量应不大于lOOcfu。阳性对照实验应检出相应的控制菌。6.6阴性对照实验：以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照实验应无菌生长。假如阴性对照有菌生:长，应进行偏差调查。7．实验技术7.1耐胆盐革兰阴性菌(Bile~TolerantGram-NegativeBacteria)7.1.1供试液制备和预培养取供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)”制成1:10供试液，混勻，在20〜25C培养，培养时间应使供试品中的细菌充足恢复但不增殖(约2小时)。7.1.2定性实验除另有规定外，取相称于lg或lml供试品的上述预培养物接种至适宜体积(经方法合用性实验拟定）肠道菌增菌液体培养基中，30〜35°C培养24〜48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30〜35°C培养18〜24小时。假如平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。7.1.3定最实验选择和分离培养取相称于o.lg、O.Olg和O.OOlg(或0.1ml、0.01ml和0.OOltnl)供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积(经方法合用性实验拟定）肠道菌增菌液体培养基中，30〜35℃培养24〜48小时。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30〜35℃培养18〜24小时。结果判断若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则相应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从表2查lg或lml供试品中具有耐胆盐革兰阴性菌的也许菌数。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第17页表2耐胆盐革兰阴性菌的也许菌数(N)各供试品量的检査结果每lg(或lml)供试品中也许的菌数cfu0.lg或0.lml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml+++—++—-+---N>10³102<N<10³10<N<102N<10注：（1)+代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长；一代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上无菌落生长。(2)若供试品量减少10倍（如O.Olg或0_01ml，0.OOlg或0.001ml，0，0001g或0.0001ml)，则每lg(或lml)供试品中也许的菌数(N)应相应增长10倍.7.2大肠埃希菌(Escherichiacoli)7.2.1供试液制备和增菌培养：取供试品:照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105)”制成1:10供试液。取相称于lg或lml供试品的供试液，接种至适宜体积(经方法合用性实验拟定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30〜35°C培养18〜24小时。7.2.2选择和分离培养：取上述培养物lml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42〜44℃培养24〜48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30〜35°C培养18〜72小时。7.2.3结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定实验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。7.3沙门菌(Salmonella)7.3.1供试液制备和增菌培养：取10g或10ml供试品直接或:解决后接种至适宜体积（经方法合用性实验拟定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30〜35C培养18〜24小时。选择和分离培养取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，30〜35°C培养18〜24小时。7.3.2取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30〜35℃：培养18〜48小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18〜24小时，或采用其他适宜方法进一步鉴定。7.3.3结果判断：若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定实验，确证是否为沙门菌。假如平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色（或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第18页7.4铜绿假单胞蔺{Pseudomonasaeruginosa)7.4.1供试液制备和壜菌培养：取供试品，照“非无菌产品微:生物限度检查：微生物计数法（通则1105)”制成1:10供试液。取相称于lg或lml供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法合用性实验拟定的）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀。30〜35T：培养18〜24小时。7.4.2选择和分离培养取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30〜35℃培养18〜72小时。取上述平板上生长的菌落进行氧化酶实验，或采用其他适宜方法进一步鉴定，氯化酶实验将洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸N，iV-二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶实验阳性，否则为阴性。7.4.3结果判断：若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有:菌落生长，且氧化酶实验阳性，应进一步进行适宜的鉴定实验，确证是否为铜绿假单胞菌。假如平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶实验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。7.5金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)7.5.1供试液制备和增蔺培养：取供试品，照“非无菌产品微:生物限度检査：微生物计数法（通则1105)”制成1:10供试液。取相称于lg或lml供试品的供试液，接种至适宜体积(经方法合用性实验拟定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混勻。30〜35°C培养18〜24小时。7.5.2选择和分离培养取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30〜35*C培养18〜72小时。7.5.3结果判断若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定实验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特性相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。7.6梭菌（Clostridium）7.6.1供试液制备和热解决：取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105)”制成1:10供试液。取相称于lg或lml供试品的供试液2份，其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。7.6.2增菌、选择和分离培养：将上述2份供试液分别接种至适宜体积(经方法合用性实验拟定）的梭菌增菌培养基中，置厌氧条件下30〜35°C培养48小时。取上述每一培养物少量，分别涂抹接种于哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下30〜35°C培养48〜72小时。7.6.3过氯化氢酶实验：取上述平板上生长的菌落，置洁净玻片上，滴加3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶实验阳性，否则为阴性。7.6.4结果判断：若哥伦比亚琼脂培养基平板上有厌氧杆菌生长（有或无芽孢），且过氧化氢酶反映阴性的，应进一步进行适宜的鉴定实验，确证是否为梭菌；假如哥伦比亚琼脂培养基平板上没有厌氧杆菌生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，或过氧化氢酶反映阳性，判供试品未检出梭菌。标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共19页第19页7.7白色念珠菌（Candidaalbicans)7.7.1供试液制备和堆菌培养：取供试品，照“非无菌产品微:生物限度检查：微生物计数法（通则1105)”制成1:10供试液。取相称于lg或lml供试品的供试液，接种至适宜体积(经方法合用性实验拟定）的沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀，30〜35℃培养3〜5天。7.7.2选择和分离：取上述预培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30〜35°C培养24〜48小时。白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色，偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱褶。挑取疑似菌落接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24〜48小时(必要时延长至72小时），或采用其他适宜方法进一步鉴定。7.7.3结果判断：若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长的菌落呈阳性反映，应进一步进行适宜的鉴定实验，确证是否为白色念珠菌；若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长的菌落呈阴性反映，判供试品未检出白色念珠菌。7.8稀释液：稀释液配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。（1）PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液照无菌检査法（通则1101)制备。（2）pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、PH7.2无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液照缓冲液（通则8004)配制后，过滤，分装，灭菌。如需要，可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加人表面活性剂或中和剂等。（3）0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml，过滤，分装，灭菌。培养基及其制备方法7.9培养基及其制备方法培养基可按以下处方制备（见中国药典2023年版，通则1107非无菌药品微生物限度标准）（第148页-149页），也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后，应按验证过的高压灭菌程序灭菌。8.附件附件1《微生物限度检查记录》（KF-SOP-07-13（J）-01）附件2《控制菌检查记录》（KF-SOP-07-13(J)-02）附件3《计数培养基合用性检查记录》（KF-SOP-07-13(J)-03）附件4《控制菌检查培养基合用性检查记录》（KF-SOP-07-13(J)-04）附件5《阳性菌使用记录》（KF-SOP-07-13(J)-05）

附件1微生物限度检查记录检查编号：KF-SOP-07-13（J）-01检品名称检品来源检品批号检查日期年月日包装规格报告日期年月日批量kg（件）检查依据中国药典2023年版四部供试品制备：常规法供试品g（ml）加无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（PH7.0）（配制批号）至ml需氧菌总数30~35℃(5)霉菌和酵母菌总数23~28℃(7)培养基配制批号：培养时间月日时～月日时培养基配制批号：培养时间月日时～月日时原液1：101：100阴性对照原液1：101：100阴性对照12121212121224h24h48h48h72h72h96h96h120h120h144h168h平均平均结果cfu/g、ml结果cfu/g、ml大肠埃希菌检查菌种编号：实验方法培养基配制批号培养时间h培养温度℃结果备注供试品阳性对照阴性对照BLMUG靛基质结论本品依据中国药典2023年版四部《通则1105》和《通则1106》进行检查，结果。检查人复核人附件2控制菌检查记录检查编号：KF-SOP-07-13（J）-02检品名称检品来源检品批号检查日期年月日包装规格报告日期年月日批量kg（件）检查依据中国药典2023年版四部大肠埃希菌检查供试品制备：取供试品（g/ml/cm2），加PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至ml，混匀，作为的供试液。培养基信息：①BL配制批号：②MUG配制批号：③EMB配制批号：培养温度：培养时间：培养箱编号：BLMUG靛基质EMB革兰染色、镜检IMRV—PC乳糖发酵供试品阴性对照阳性对照结果□检出□未检出（规定：）大肠菌群检查供试品制备：取供试品（g/ml），加PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至ml，混匀，作为的供试液。培养基信息：①乳糖胆盐发酵培养基配制批号：②EMB配制批号：③乳糖发酵培养基配制批号：培养温度：培养时间：培养箱编号：乳糖胆盐发酵培养基EMB乳糖发酵培养基供试品10-110-210-3阴性对照结果（规定：）沙门菌检查供试品预增菌：取供试品（g/ml），直接接种于200ml营养肉汤培养基中，混匀，即得。培养基信息：①营养肉汤培养基配制批号：②四硫磺酸钠亮绿培养基配制批号：③胆盐硫乳琼脂培养基配制批号：④EMB配制批号：培养温度：培养时间：培养箱编号：