第四章 肠道菌群的

第四章肠道菌群的检验大肠菌群EnumerationofColiforms粪大肠菌群EnumerationofFaecalColiforms大肠杆菌EnumerationofEscherichiacoli一大群居住在人和动物肠道中生物学性状近似的革兰阴性杆菌属于肠杆菌科多数是肠道的正常菌群，至少有30个菌属，120个以上的菌种少数为致病菌，是胃肠传染病的最重要病原菌肠道杆菌(entericbacilli)乳糖发酵试验共同特性1、相似的形态染色2、简单的培养条件3、活泼的生化反应重要试验初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌肠道致病菌肠道非致病菌多数不发酵乳糖多数发酵乳糖5、抵抗力不强6、易变异溶源性转换生化反应性变异通过引起耐药性变异毒力性变异转导接合4、抗原构造复杂

肠道杆菌生物特征1．形态与结构：中小等大小两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，无芽胞，多数有鞭毛，大多有菌毛，少数有荚膜或包膜。2．培养特性：需氧或兼性厌氧菌，在普通培养基和麦康凯培养基上生长良好，为中等大小的光滑型菌落。有些菌在血琼平板上出现β型溶血，在液体培养中呈均匀混浊生长。3．生化反应：发酵葡萄糖，氧化酶阴性。生化反应活泼，一般说来，生化反应的强弱与其致病作用成反比。肠道杆菌流行病学抵抗力：不强，加热60℃经30分钟即死亡。不耐干燥,胆盐、煌绿等对大肠杆菌等非致病菌有选择性作用，可制备肠道杆菌选择性培养基以分离肠道致病菌。对一般化学消毒剂如漂白粉,酚,甲醛均敏感,对低温有耐受力.临床意义:肠杆菌科细菌可致化脓性疾病,肺炎,脑膜炎,败血症以及伤口,泌尿道和肠道的感染,本科细菌占临床分离细菌总数的50%和临床分离的革兰氏阴性菌总数的80%,将近50%的败血症,70%以上的泌尿道感染是由肠杆科细菌引起.传播方式：污染的饮水及食物、经消化道传播。肠杆菌科中与卫生医学有关的细菌

大肠菌群为革兰氏阴性菌一、大肠菌群检验第一法大肠菌群MPN法第二法大肠菌群平板计数快速法大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法MPN最大或然数（mostprobablenumber，MPN）计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放。MPN法的原理MPN法的局限性——相同MPN值，但含义不同MPN值为90时，有四种不同情况的阳性管数。阳性管数为“0-0-0”“0-1-2”对应的最大概率（Pmax）极小，此时的MPN值90MPN/100ml(g）无意义，所以在《FDA细菌学手册》中，已删除了这两种情况。MPN法的局限性——相同MPN值，但含义不同

阳性管数为“0-3-0”对应的最大概率（Pmax）为0.00417%，而国标中并没有列出相应的95%置信区间，是考虑到该置信区间过广，已没有很大的指导意义。阳性管数为“2-0-0”的最大概率（Pmax)为31.91613%，表明实际的菌落数在10~360cfu/100ml(g）之间。所以，测定MPN值时，要考虑阳性管数。相同的MPN值，代表的实际菌落数范围却有很大的差别。假如你的产品标准为100MPN/100g，实测值为90MPN/100g（阳性管数“0-3-0”），那么很难判定你的产品是否合格。MPN值的准确度随Pmax的减小而减小

不同MPN值对应的Pmax值不同，且随着Pmax值的减小，MPN值的准确度也明显下降，所以在《FDA细菌学手册》中已删除了极低Pmax值（<0.004%）的情况，因为这些Pmax值对应的MPN值没有实际的指导意义。MPN法检测的隐性成本

产品的大肠菌群标准为30MPN/100g，而某个样品的检测结果为90MPN/100g，那么你可能会认为你的产品不合格。但是，让我们看一下90MPN/100g的置信区间，为10~360cfu/100g，也就是说有部分结果为90MPN/100g的产品，且实际菌落数在10~30cfu/100g之间，会被当作不合格产品处理。30MPN/100g的置信区间为<5~90cfu/100g（阳性管数0-0-1）或<5~130cfu/100g（阳性管数0-1-0）。也就是说部分实际菌落数为30~130cfu/100g的产品，会被当作合格产品，从而微生物风险增加。大肠菌群大肠菌群系指一群在36℃能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。

第一法

大肠菌群计数MPN法抑菌剂的选择大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。

检样稀释以无菌操作将检样25ml(或25g)放于含有225ml灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1：10的均匀稀释液。调pH为6.5～7.5。用1ml灭菌吸管吸取1：10稀轻液1m1．注入含有9ml灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀．作1：10的稀释液。另取1m1灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1m1灭菌吸管：根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。

初发酵试验在乳糖发酵过程中，观察产气和产酸两个现象。将待检样品接种于LST发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料LST发酵管；1m1及1m1以下者，用单料LST发酵管，每一稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，进行分离和鉴定。LST结果判断大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。复发酵大肠菌群最大可能数检索表其它全部为0，报告为＜最低检出线如样品中大肠菌群较少，可加大接种量，采取双料发酵管大肠菌群计数第二法——直接计数法CFU通过数据直接求数学期望倾注培养根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46℃结晶紫中性红胆盐琼脂培养基（VRBA平板）注入平皿约15～20mL，并转动平皿，混合均匀。同时将1mL稀释液（不含样品）作空白对照。待琼脂凝固后，倒入3～4mLVRBA培养基铺面，培养基凝固后翻转平板，置36±1℃温箱内培养18～24h。平板菌落数的选择选取菌落数在15～150之间的平板，分别计数典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径约为0.5mm。

从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36

℃±1

℃培养24

h～48

h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

证实试验大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1

mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105

CFU/g（mL）。其他方法

大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法二、粪大肠菌群(faecal

coliform)定义：一群能在44.5℃,24-48h内发酵乳糖,产酸产气的需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌检测意义：粪大肠菌群的来源是人和温血动物粪便，作为粪便污染的指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。比大肠菌群更加直接。粪大肠菌群(faecal

coliform)的测定

GB4789.39-2013三、大肠杆菌（E.coli）细菌域(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichia)、大肠杆菌种(E.coli)。它是一种普通的原核生物，是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。

大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）定义：广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为＋＋－－或－＋－－的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。IMViC生化试验：细菌的生化反应吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）、枸橼酸盐利用（C）四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。用于鉴别形态、革兰染色反应和培养特性相同或相似的细菌。大肠杆菌

G-短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。兼性厌氧菌。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。菌名菌落形态大肠埃希氏菌紫黑色，有绿色金属光泽肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深阴沟肠杆菌粉色，中心色深弗氏志贺氏菌无色鼠伤寒沙门氏菌无色粪链球菌无色大肠杆菌的MPN计数法

（GB4789.38-2012）大肠杆菌在EMB平板大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别大肠埃希氏菌平板计数法检验程序（第二法）倾注平板选取2个～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。将10mL～15mL冷至45℃±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3mL～4mL结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮）（VRBA-MUG）覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36℃±1℃培养