高效液相色谱柱的正确使用 液相色谱操作规程

第第页高效液相色谱柱的正确使用液相色谱操作规程色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。关于色谱柱的安装、维护、保色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。关于色谱柱的安装、维护、保存以及由色谱柱导致的这样那样的色谱故障也是一门学问。高效液相色谱柱的正确使用包含：加装保护柱，过滤流动相和样品，净化样品，避免过高的柱压，注意温度和酸碱度，正确及时的冲洗等。1.加装保护柱保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样品的化学“拉圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。尽管现在的色谱仪在流动相吸入口、进样阀后部以及在色谱柱的两端都装有1、2μm等不同孔径的滤器,但滤器只能除去不溶性颗粒而不能除去化学污染,因此,加装保护柱是必要的,特别是在分析中药、中成药等复杂混合物和生物样品时更是保护分析柱必不可少的措施。保护柱填料应与分析柱一致,粒径可较分析柱大。保护柱属消耗品,经过一定次数的样品分析(5～1次)后,出现柱压显著升高或峰形变坏或基线漂移时,应考虑更换保护柱。2.过滤流动相和样品流动相通常由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成,原则上,所有经过色谱柱的流动相均应过滤,但在实际操作上应视具体情况而有所区别:当有机溶剂用色谱纯级,水用石英亚沸水或其它超纯水时,在能确保水和有机溶剂的质量且没有受到污染时,过滤并无更多实际意义。当流动相中含有缓冲盐时,则过滤是必要的,如前所述,当缓冲溶液放置一段时间(视环境温度不同而异,夏季一般不超过48h,冬季一般不超过一周)后,在使用前还应重新过滤。所配制的样品试液在注入流路系统前均要经.45μm(.22μm则更好)孔径滤膜过滤。要注意区分水系和油系,二者不可混用,以防止滤膜溶解而造成污染。装流动相的容器和色谱系统中的在线滤器要定期清洗和更换,以避免滤器因过载而起不到过滤作用。3.净化样品当样品中含有对色谱柱有损害的化学成分,如产生永久性吸附的蛋白质、糖等有机分子和强吸附性物质,以及可能对柱填料产生破坏作用的基团离子。在进样前应尽可能对样品进行分离提纯以除去多余杂质组分。4.避免过高柱压虽然高效液相色谱柱能耐受的压力可达6psi(磅/平方英寸),但过高及过大的压力变化均会缩短色谱柱的寿命,避免的方法是(1)柱压过高时,尽可能采用较小的流速,以不超过柱最大允许压力的一半为宜。(2)当流速较大时,应采取流速梯度的办法使流速分步到位。(3)使用手动进样阀时,进样阀的切换要尽可能的快。否则超过2%的压力冲击会很快使柱报废。当使用多柱联用时,柱切换要避免在高压下进行。5.注意温度和酸碱度一般以硅胶为基质的色谱柱最高使用温度不超过6℃,以低于4℃为宜,特别是在流动相pH接近使用限度时,更应降低使用温度。温度过高会加快键合相的水解和硅胶的溶解,从而使填料性质改变,柱床塌陷,降低柱效,改变峰形。目前的键合硅胶色谱柱标示的pH适用范围可达2～1,但在实际使用时应避免极端的pH条件,特别是在偏碱性的条件(pH≥8)下使用,如必须要在极端的pH条件下使用时,可通过以下方法避免柱损害:(1)在泵和进样阀之间加装预柱(饱和柱)来饱和流动相(2)降低使用温度(3)检验完毕后立即用与所使用的流动相互相混溶的“温和溶剂”彻底清洗。6.正确及时的冲洗开始试验前,应了解柱中当前是何种溶剂。对于新色谱柱,如无特殊说明均为评价报告中所用流动相。柱中当前溶剂一定要与分析样品所用流动相互溶,如不能混溶,要用与二者均能相互混溶的第三种溶剂过渡。仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。相关热词：等离子清洗机,反应釜,旋转蒸发仪,高精度温湿度计,露点仪,高效液相色谱仪价格,霉菌试验箱,跌落试验台,离子色谱仪价格,噪声计,高压灭菌器,集菌仪,接地电阻测试仪型号,柱温箱,旋涡混合仪,电热套,场强仪万能材料试验机价格,洗瓶机,匀浆机,耐候试验箱,熔融指数仪,透射电子显微镜。进样阀在进样过程中，必须是非常清洁的，否则得不到较好的结果。进样阀切换到进样位置后（Inject），要在此位置上保持一段时间，使流动相充分冲洗样品定量管，这样可以保证有较高的精确度，而且不用另外再冲洗样品定量管。这种有色谱仪器控制的冲洗显然要比手动冲洗的更好些。注意：冲洗需要的流动相体积至少为所进样品的10倍。例如，如果取20ul样品至100ul的定量管中，而流动相此时的流速为1ml/min，则需要在进样位置上至少保持12s，即：20ul×10/1000ul·min-1＝0.2min＝112s。当样品定量管经过充分的冲洗后，可以将旋柄转回取样位置(Load)，也可以继续保持在进样位置，到下次取样前才切换回取样位置。在切换回取样位置时，将样品进样针或微量样品进样针从进样阀中拔出。为防止交叉污染，正常情况下不必每次进样后都清洗进样阀注射针导入口。进样阀内根据专利设计的直接连接进样孔，可以使注射针头的前端直接连接到样品定量管的末端，没有其他空间供样品残留。这样在下一次进样时，就不会有上一次残留的样品进入定量管。但是进样针头插入或拨出过程中，会有痕量的样品沉积在针头密封区域。精密的测定显示这种残留有1nl-10nl。这表明进20ul样品，会残留0.005%～0.05%。每次进样后冲洗注射针导入口可以将此残留冲洗干净。冲洗注射针导入口的过程为：设定流动相流速为0.1ml/min～1ml/min，将注射针导入口冲洗头连接到一只体积较大的注射器上，用大量的流动相只在进样位置清洗注射针导入口。这样进入进样阀中的液体绕过样品定量管由样品溢出管口排出。这一过程可以将注射针导入口、引导管、注射针导入管和注射针密封圈彻底清洗。而采用注射器完全插入式的冲洗方式，则不能全部清洗上述部件的表面。在取样位置将注射针插入注射针导入口时，针头推动注射针密封圈内少量样品液体（上一次冲洗注射针导入管留下的）进入样品定量管。当该样品液体与所用的流动相组成不同，且同时采用部分充满定量管的进样方式时，在高灵敏度的检测器上可能出现怪峰。所以冲洗注射针时可以用流动相冲洗。如果已发现有严重的交叉污染现象，请检查是否有下列原因造成：1.使用的注射针头长度不够（针头的长度至少5cm），注射针末端不能到达定子表面。2.注射针没有充分插入注射针导入口。3.注射针导入口的污染物或针头密封磨损下来的削片，使注射针末端不能接触定子表面。如果不考虑交叉污染，每进样10次，或20次可以冲洗一下注射针导入口，这样可以保证注射针导入管内充满流体。在注射针插入或拔出的过程中，清洗注射针头或稀释污染这一区域的样品的同时也使注射针导入口和样品溢出口充满流体，从而防止空气进入样品管。如何让液相色谱柱的测试结果更有可比性液相色谱柱在使用前，可以进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要留意：液相色谱柱柱性能可能由于所使用的样品、活动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是较佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。1、样品的前处理：a、可以使用活动相溶解样品。b、使用予处理柱除往样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、使用0.45μm的过滤膜过滤除往微粒杂质。2、活动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与活动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求活动相具备以下的特点：a、活动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保存在柱中）。b、活动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应（特殊情况除外）。c、活动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命（可运用进步温度的方法降低活动相的黏度）。d、活动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，可以使用对紫外吸收较低的溶剂配制。e、活动相沸点不要太低，否则轻易产生气泡，导致实验无法进行。f、在活动相配制好后，