第五章 DNA的复制课件1

第五章DNA的复制第五章DNA的复制第一节概述第五章DNA的复制一、研究DNA复制的目的任何一种生物都必须具有繁衍后代并将自身的遗传物质传递下去的最基本的能力。就长期而言，每一种生物都必须不断地改变和优化自己的遗传物质，以便更好地适应外部环境的改变，并在变化的环境中生存下来。但就短期而言，生物个体为了生存，必须保证遗传信息的高度稳定性和准确性。第五章DNA的复制因为绝大多数的变异都是有害的，可能引起诸如癌症、血友病、白化病和各种各样功能缺失性疾病，如果这些变异出现在性细胞上，就有可能遗传给后代，而有功能缺失变异的后代在长期自然选择中将被淘汰，只有极少数有益的变异被后代传承下来，成为物种进化的遗传物质基础，这就是达尔文的优胜劣汰，适者生存的进化论。第五章DNA的复制DNA是由两条核苷酸链构成的双螺旋分子，生物体成长发育和繁衍后代所需要的所有的遗传信息都储藏在DNA的序列里。生物物种的传递和个体数目的增殖是通过细胞分裂来实现的。细胞分裂发生时，亲代细胞都必须将携带的DNA准确地复制成两份并分配到两个子代细胞中去。第五章DNA的复制第五章DNA的复制二、历史的回顾在研究基因遗传学的历史上，最重大的发现莫过于Watson和Crick于1953年提出的DNA双螺旋结构理论，以及随后提出的DNA半保留复制假说(semiconservativemodel）。根据他们的假说，双螺旋DNA在复制过程中各以其中一条链为模板，通过碱基互补配对(A-T，G-C)合成另一条互补DNA序列。新生的互补链与母链构成子代DNA分子，因此DNA双螺旋被“半保留”地复制。第五章DNA的复制第五章DNA的复制1957年，Kornberg首次发现了大肠杆菌的DNA聚合酶(DNA聚合酶I)。随后于1958年，DNA半保留复制的假说也被MatthewMeselson和FrankStahl的实验所证实。60年代早期的研究发现，正在复制的染色体上有一个移动的Y字型复制区域，这个区域被称为复制叉。1968年对细菌DNA复制的研究发现存在着冈崎片段(Okazakifragment)，进而提出了不连续复制的学说。目前已知参与DNA复制的蛋白就超过20种，肯定还存在一些未知的蛋白因子，因此DNA的复制还有待进一步深入研究。第五章DNA的复制第二节DNA复制的基本规律和几种复制模型第五章DNA的复制一、半保留复制①．一端沿氢键逐渐断开；②．以单链为模板，碱基互补；③．氢键结合，聚合酶等连接；④．形成新的互补链；⑤．形成了两个新DNA分子。第五章DNA的复制第五章DNA的复制二、几种复制模型第五章DNA的复制1、凯恩斯(Cairns)复制模型第五章DNA的复制2、滚环(或滚筒)复制模型首先一个引发体组装在模板链（＋链）上，开始合成RNA引物，然后在DNApolⅢ作用下，引物延伸生成一个互补链（－链）。生成的双链DNA分子通过一个噬菌体编码的内切酶在＋链上的特定部位制造一个缺口。最后在DNApolⅢ作用下，＋链从暴露出的3’羟基延伸，取代原来的＋链。第五章DNA的复制3、非环状复制第五章DNA的复制第五章DNA的复制三、不连续复制第五章DNA的复制DNA的合成至少在一条链上是以不连续的方式进行的。复制叉向前移动，留下两条单链作模板合成新的子链。合成方向与复制叉前进方向一致的一条子链称为前导链(1eadingstrand)，原则上前导链的合成是连续的；而另一条与前导链走向相反DNA子链称为后随链(1aggingstrand)。随着复制叉的推移，后随链将沿着与复制叉移动相反的方向，先合成一些小的DNA片段，然后在DNA连接酶的作用下，再彼此连接成一条完整的DNA长链。第五章DNA的复制

第三节参与DNA复制的几种主要的酶第五章DNA的复制按照它们的功能可以分成三类：一类是在复制中能够影响DNA结构的酶，如拓扑异构酶和解旋酶等，它们主要负责将DNA的超螺旋、双螺旋双链松散，打开成DNA单链或者向松弛的双链闭环DNA分子引入超螺旋。另外一类是参与DNA合成的酶，如DNA引发酶，DNA聚合酶和DNA连接酶等，主要负责DNA的合成和将小片段DNA连接成DNA的长链。还有一类是没有酶活性的辅助蛋白因子，如单链结合蛋白(single-strandDNA-bindingprotein，SSB)、DNA聚合酶辅助蛋白因子等。第五章DNA的复制第五章DNA的复制首先是解旋酶(helicase)解开双链DNA，拓扑异构酶(topoisomerase)在复制叉前面引入负超螺旋，消除由于解链产生的正超螺旋，然后DNA聚合酶(DNApolymerase)的多酶聚合体催化脱氧核苷酸加入到与模板互补的核苷酸链的3’端，延伸DNA链.DNA链的延伸需要一段引物(RNA片段),该引物由DNA引物合成酶(DNAprimase),或称引发酶合成.第五章DNA的复制DNA合成方向为5’-3’，模板阅读的方向为3’-5’。前导链的合成是连续的，后随链合成短的不连续的冈崎片段，每一段都有自己的引物。FENl内切酶(flapendonuclease)切开RNA引物与DNA的连接，由RNA酶H降解RNA引物，其缺口由DNA聚合酶δ/ξ补齐，最后DNA连接酶(DNAligase)将冈崎片段连接起来形成连续的DNA链。第五章DNA的复制增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)是DNA聚合酶的辅助蛋白因子，帮助DNA聚合酶复合物形成环状结构固定在DNA模板上，在复制时不至于从模板上脱落下来。RPA(replicationproteinA，RPA)是单链DNA结合蛋白(相当于大肠杆菌的SSB)，与单链DNA结合，并使之稳定。第五章DNA的复制一、拓扑异构酶(topoisomerase)拓扑异构酶广泛存在于各种生物，在大肠杆菌中即已发现4种。其中的拓扑异构酶Ⅰ能与磷酸基团共价连接，切断磷酸二酯键，使DNA单链产生瞬间缺口，致使两边的DNA链能够自由旋转，从而解除DNA链上的正超螺旋，使DNA复制得以继续进行。由于切开的磷酸二酯键的能量储存在拓扑异构酶与磷酸基团的连接键中，当它从DNA磷酸基团释放时，储存的能量可让切开的磷酸二酯键重新连接，因此被看作是一种可逆性的核酸酶(图5-11)。第五章DNA的复制第五章DNA的复制另外一种DNA拓扑异构酶是拓扑异构酶Ⅱ，又称为DNA旋转酶(DNAgyrase)，由A和B两个亚基组成。B亚基带有ATP水解酶，能结合ATP，具有水解ATP的能力。拓扑异构酶Ⅱ往往作用在染色体上两条双链NA互相交叉的位点，利用ATP水解提供能量有效地完成以下反应：①切断其中一条双链DNA形成一个缺口(为另外一条双链DNA开一道“门”)，两个亚基与断开的末端共价连接；②使另外一条双链DNA通过缺口；③重新封闭缺口并离开DNA(图5—12)。第五章DNA的复制通过这种方式，拓扑异构酶Ⅱ能有效地将两条交叉的DNA链分开，防止在DNA复制过程中出现严重的DNA缠绕(图5-13)。这种功能在变异的酵母细胞中可以显示出来。一种变异的酵母在转换到37℃的条件下培育时，它的拓扑异构酶Ⅱ将失去活性，这时它的子代染色体在DNA复制后，将保留着相互缠绕的状态而不能分开。第五章DNA的复制第五章DNA的复制二、解旋酶(DNAhelicase)DNA在复制、修复和连接过程中，两条互补链必须部分分开以形成单链DNA，即解旋。该过程是由DNA解旋酶催化完成的，DNA解旋酶也称为解链酶或螺旋酶。当解旋酶与DNA单链结合时，可利用水解ATP产生的能量打断互补碱基配对的氢键，以每秒1000个碱基对的速度将双螺旋打开，促使解链酶沿DNA链推进(图5—14)。第五章DNA的复制第五章DNA的复制NA双螺旋模板的解旋需要两个解旋酶协同作用，一个沿着前导链合成方向移动，另一个沿着后随链合成方向移动，因为两条链的方向相反，两个酶的运动方向也正好相反，因此可以认为是两种不同的酶，事实上也的确存在这两种类型的解旋酶。第五章DNA的复制解旋酶多以六聚体或二聚体的形式存在。利用电镜图像重建和X射线衍射技术显示，噬菌体T7的解旋酶是一个由6个相同的亚基组成的六聚体环，环上有ATP结合位点。第五章DNA的复制三、单链结合蛋白(SSB)双螺旋DNA被解旋酶打开后，形成单链的DNA，单链区将与单链结合蛋白(singlestrandDNA-bindingprotein，SSB)结合，避免单链退火或形成链内的氢键。单链结合蛋白又称双螺旋去稳定蛋白(helix-destabilizingproteins，HDP)。第五章DNA的复制性质它不具有任何酶的活性，也无需水解ATP提供能量，由于它对已变性的DNA具有强烈的亲和能力，因此能彼此协同地与单链DNA(复制叉的单链区)紧密结合，以避免单链退火和在单链内部由于碱基配对形成发夹结构，同时还将加强单链DNA与DNA聚合酶的亲和力。SSB与DNA的结合没有序列专一性，当DNA聚合酶前进时，将置换出结合在单链上的SSB蛋白。第五章DNA的复制第五章DNA的复制SSB蛋白的发现SSB蛋白首先是从噬菌体T4感染的大肠杆菌中分离制得的，它是噬菌体T4的基因32编码的产物(gp32)，分子量为35000Da，以单体形式存在。后来，在其他原核以及真核细胞如大肠杆菌、大肠杆菌噬菌体、小牛胸腺细胞以及鼠和人细胞中都相继发现了SSB蛋白。第五章DNA的复制第五章DNA的复制四、引发酶(DNAprimase)DNA聚合酶的一个共同特征是只能催化脱氧核糖核苷酸加到DNA链的3’-羟基上，因此需要引物提供3’-羟基端，而不能从游离核苷酸起始合成。该引物是由DNA引发酶(也称引物酶)催化合成的大约10nt的RNA片段。十分重要的功能是充当前导链上DNA聚合酶的“刹车板”。第五章DNA的复制第五章DNA的复制五、DNA聚合酶(DNApolymerase)DNA聚合酶是指以脱氧核苷三磷酸dNTP为底物，以DNA为模板催化合成DNA的一类酶。它广泛存在于各种不同的生物包括细菌、植物和动物中。所有DNA聚合酶的作用方式都基本相同，可用以下的一个简单方程表示：

(dNMP)n+dNTP=(dNMP)n+1+ppi第五章DNA的复制DNA聚合酶所需要的反应条件包括四种dNTP、Mg2+以及引物和DNA模板。引物的作用是启动DNA的合成，它可以是RNA，也可以是DNA以及RNA-DNA的共聚物，但引物的3’端必须具有游离的羟基(3’-OH)，因此DNA聚合酶的作用是促使dNTP加到引物或正在延伸中的DNA链的3’-OH端，催化DNA链的合成。添加的dNTP的种类由模板DNA决定，催化合成的方向即DNA链延伸的方向为5’-3’。第五章DNA的复制引物-模板结构有下列五种情况:第一种是完整的双链DNA，无论它是线状还是环状的，都不能作为DNA合成的模板；第二种是带有一个缺口的双链DNA，它可以作为某些DNA聚合酶的模板；第三种是带引物的双链DNA；第四种是有引物的单链DNA，几乎所有的DNA聚合酶都能利用它作为底物，这一小段引物可以是DNA，但多数情况下是RNA。第五章DNA的复制第五种是单链DNA，T4DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I和真核细胞DNA聚合酶d都能利用它作为引物-模板，当使用单链DNA作引物-模板时，DNA聚合酶能使单链DNA的3’-尾端部分回折与自身的一段DNA的碱基配对结合，未能配对的3’-尾端部分被聚合酶的3’-’5’外切活力切除，留下游离的3’-OH端，然后在DNA聚合酶的作用下，从该3’端开始合成DNA，这样的单链DNA显然具有双重的作用，它既是模板，又是引物。第五章DNA的复制第四节DNA复制的过程DNA复制的过程大致可分为三个阶段：复制的起始、复制的延伸、复制的终止。第五章DNA的复制一、复制的起始DNA的双螺旋结构非常稳定，两条DNA链由无数碱基对间的氢键紧紧连在一起。DNA的复制是由起始蛋白结合在双链DNA上，并将两条链解开而开始的。但DNA复制不是一个随机的过程，而是从DNA分子上一个或多个特定的位点开始的，这样的位点称为复制起始位点(originofreplication)，常用ori表示。第五章DNA的复制一、复制的起始原核生物的DNA只有一个复制起点，复制从这里开始，进行到终点(terminus)结束，完成整个DNA分子的复制，因此原核生物的染色体只有一个复制单位(也称为复制子，replicon)。真核生物的DNA复制是从多个位点开始的，所以真核生物的DNA复制有多个复制子。第五章DNA的复制二、复制的延伸一般而言，DNA复制首先是起始蛋白结合在DNA起始位点上，形成前引发复合体，并将起始位点某些特定区域的双螺旋结构打开，为DNA延伸所需要的多种酶的结合提供空间。首先加入到引发复合体中的是解旋酶，它负责解开双链DNA，由拓扑异构酶去除由于解链产生的超螺旋。第五章DNA的复制然后引发酶和DNA聚合酶组成的被称为复制体(replisome)的多酶聚合体结合上去，合成RNA引物，催化脱氧核苷酸加入到与模板互补的核苷酸链的3’端合成DNA链。DNA合成方向是5’—3’，模板阅读为3’—5’。前导链的合成是连续的，后随链合成的是不连续的冈崎片段。在DNA合成完毕之后，由RNA酶降解清除冈崎片段的RNA引物，再由DNA聚合酶将缺口补齐，最后DNA连接酶将各个冈崎片段连接起来成为连续的DNA链.第五章DNA的复制三、复制的终止

DNA复制的时候，复制叉前进时如果不遇到特殊的终止信号，将一直复制下去，如果到达DNA的末端，或者遇到下一个复制叉，DNA复制就会终止。

第五章DNA的复制第五节确保DNA复制准确性的机制第五章DNA的复制DNA复制具有非常高的精确度，平均每复制109个核苷酸，才有一个核苷酸的差错。这种以碱基的精确互补配对为基础的复制，其高精确度虽已超乎人们的想像，但碱基配对有时仍会产生差错。

第五章DNA的复制例如，稍微改变DNA螺旋的构象，也能让G和T之间形成两个氢键。此外，四个DNA碱基出现瞬间互变异构体(tautomers)的概率是万分之一到十万分之一，在DNA双螺旋构象不发生改变的情况下，这些碱基互变异构体之间也能形成错配，如C配A。如果DNA聚合酶对这些引入的脱氧三磷酸核苷酸与DNA模板之间的错配不予校正，则将导致频繁的变异。

第五章DNA的复制DNA复制的准确性不仅仅依赖于碱基的配对，还得依靠许多“校对”的机制不断地纠正可能发生的差错。校对的第一步发生在新的核苷酸参与合成之前，由DNA聚合酶来完成。一方面是由于正确配对的核苷酸与DNA聚合酶的亲和力比错配的核苷酸大。另一方面是因为核苷酸与DNA聚合酶结合之后，聚合酶的构象将发生改变，不正确的核苷酸容易与DNA聚合酶发生分离，从而达到校正的目的。第五章DNA的复制第二步校对发生在新的核苷酸添加上去之后，由DNA聚合酶3’—5’的外切活性来完成。因为通过第一步还没有得到校正的错配的核苷酸，不能提供合适的3’-OH，供DNA聚合酶作用，使链延伸。这时DNA聚合酶将用其相对独立的催化位点(或者分开的亚基)，即3’—5’外切酶位点将错配的核苷酸切除。第五章DNA的复制用外切酶位点变异的聚合酶，使错配的核苷酸停留在聚合酶外切位点，即保持其不被切除的状态(图5-34B)，或者在正常的聚合过程中加入Mg2+的螯合剂，抑制DNA聚合酶的活性，使反应终止，让DNA新链停留在聚合位点(图5-34A)，将聚合酶的修正状态和聚合状态分别固定下来，第五章DNA的复制然后通过X-衍射成像技术即可观察到DNA聚合酶的这两种构象。进一步的研究表明，DNA聚合酶是采取“自