细胞生物学评价实验手册

生物材料细胞生物学评价实验手册细胞培养技术（一）试剂配制1.L-DMEM,H-DMEM基础培养液700ml超纯水溶解一包L-DMEM培养基（内含10g粉末）或H-DMEM培养基（内含13.4g粉末），并称取2.2g碳酸氢钠融入其中，搅拌后定容至1000ml。（调PH7.2-7.4）2.L-DMEM,H-DMEM完全培养液L-DMEM基础培养液加入10％的胎牛血清，0.22µm过滤器除菌，4℃3.25×PBS（储液）称取：氯化钠50g，氯化钾1.25g，磷酸氢二钠18.1g，磷酸二氢钠1.56g，加入约200ml水中，充分溶解后定容至250ml（调PH7.2-7.4），室温保存。4.1×PBS（工作液）取40ml25×PBS稀释25倍，即加超纯水定容至1000ml，高温灭菌。（调PH7.2-7.4）5.0.25％/0.02%胰酶/EDTA称取2.5g胰酶，0.4gEDTA溶解于约900ml1×PBS中，搅拌充分溶解后，4℃过夜。第二天，调PH值至7.2，定容至1000ml，0.22µm过滤器除菌，46.细胞冻存液L-DMEM/H-DMEM基础培养液、胎牛血清和DMSO按照1：3：6的比例混和，0.22µm过滤器除菌。7.成脂诱导液（1）脂肪诱导液(AI)在H-DMEM完全培养液加入终浓度为1μmol/L地塞米松、0.5mmol/LIBMX、100mmol/L吲哚美辛和10μg/ml牛胰岛素，0.22µm过滤器除菌，4℃（2）脂肪保持液(AM)在H-DMEM完全培养液加入终浓度为10μg/ml牛胰岛素，0.22µm过滤器除菌，4℃8.成骨细胞诱导液（OS）在L-DMEM完全培养液加入终浓度为0.1μmol/L地塞米松、10mmol/L甘油磷酸钠和50mg/mlVitC，0.22µm过滤器除菌，4℃9.成软骨诱导培养液高糖DMEM＋10ng/mLTGF-β3+50ng/mLIGF-1+20%FBS10.油红O染液的配制用蒸馏水稀释异丙醇稀释至60％，加入油红O直至不再溶解，37℃11.茜素红染液的配制茜素红2g溶解于100ml蒸馏水中，用10％氢氧化氨调PH值至4.2，室温保存。附：成骨分化培养基储液的配制：1.AscorbidAcid(VitaminC)sigma公司产品（目录号是A4544）储液浓度是20mM，使用终浓度是0.2mM。配制方法是：秤取35.22mg溶解于10ml超纯水中，分装成1ml，－20℃2.β－glycerophosphatedisodiumsalt，pentahydrateCalbiochem公司产品，目录号是35675储液浓度是1M，使用浓度是10mM。配制方法是：秤取15.3g，溶解于40ml超纯水中，溶解之后，定容至50ml，分装成1ml，－20℃地塞米松(dexamethasone)sigma公司产品，目录号是D4902或D1756。储液浓度是1mM，使用浓度是0.1μM。配制方法是：秤取4mg，溶解于10ml无水乙醇中，分装成1ml，－20℃成脂分化培养基储液的配制：indomethacin（吲哚镁辛），sigma公司产品，目录号是I7378储液浓度是100mM，使用浓度是0.2mM配制方法是：秤取358mg，用10mlDMSO（sigma公司产品，目录号是D2650）溶解，分装成0.4ml，－20℃insulin，sigma公司产品。目录号是I6634储液浓度是5mg/ml，使用浓度是10μg/ml。配制方法是：秤取50mg，用10ml的0.01N的HCL溶解（将浓盐酸稀释1200倍），用一次性过滤器过滤除菌之后，分装成0.5ml，－20℃注意：insulin使用时要注意保持insulin储液的无菌，经过除菌的insulin可在4℃IBMX，sigma公司产品，目录号是I5879储液浓度是250mM，使用中浓度是0.5mM配制方法是：秤取222mg，溶解于4mlDMSO，分装成0.4ml，－20℃地塞米松(dexamethasone)sigma公司产品，目录号是D4902或D1756。储液浓度是1mM，使用浓度是1μM。配制方法是：秤取4mg，溶解于10ml无水乙醇中，分装成1ml，－20℃（二）细胞原代培养1.人骨髓间质干细胞原代（hMSCs）骨髓取自非造血系统、非遗传性疾病且未累及骨髓的正常成人骨髓,一般20ml.（1）骨髓用1XPBS按1:1稀释（2）用吸管将骨髓缓缓加入含Ficoll-Hypaque（淋巴细胞分离液，1.077g/ml）的无菌离心管中，两者体积之比是4：6。（3）离心，2000rpm×20min，缓缓减速（离心机降速设置为0）。（4）离心结束后，在淋巴分离液与上层血清之间可见一白色薄细胞层，即为有核细胞层。小心吸出细胞加入1×PBS中洗涤细胞一次后（5）用1mlL-DMEM完全培养液重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，标记为P0。（20ml骨髓可接种3-4个25CM（6）3d后全量去除非贴壁细胞，此时可见单个或数个长梭形细胞形成的克隆。以后每3~4d全量换液一次。（8）10～20d，原代细胞达到80～90%融合后传代培养2.大鼠骨髓间质干细胞（RMSCs）的原代培养（1）四周龄SD鼠脱颈处死，75%酒精浸泡5min（2）无菌条件下分离剪取两侧大鼠股骨及胫骨近端（3）用1ml注射器吸取L-DMEM培养基反复冲洗分离的股骨及胫骨（4）骨髓冲洗液离心后接种到细胞培养皿中（5）3d后换液，倒置显微镜观察克隆的形成（6）7～10d，原代细胞达到80～90%融合后传代培养3.兔软骨细胞的原代培养2-4周龄新西兰大白兔苯巴比妥钠麻醉后耳缘静脉注射空气迅速处死,剥皮后用大剪刀分离膝关节处肌肉等软组织，暴露膝关节。无菌条件下用手术刀片仔细从兔膝关节表面削下软骨组织片，收集在PBS中，充分剪成ｌmm3以下的组织块，用PBS清洗3遍。加入软骨体积10~15倍的0.25%胰蛋白酶37℃消化0.5-1小时，再用PBS冲洗两遍，加入0.2%II型胶原酶的D-Hanks消化液，37℃消化4-6小时以上，每2小时收集细胞悬液一次，直至软骨组织块基本消失、溶液变混浊为止，加入含10%小牛血清的DMEM培养液,稀释II型胶原酶,终止消化并将细胞团吹打成单个细胞后用200目滤网过滤,收集滤液,3000r/min离心5min。弃上清,收集滤液。计数细胞，以1×105～1×106个/ml的密度接种，置于37℃、5％CO2（三）细胞传代培养原代培养至细胞约80－90%融合，用胰酶进行传代。先将旧培养液弃去，1×PBS洗两次后加入0.25%胰酶，于镜下观察。见细胞变圆即将脱壁时，拍打瓶底数次，加入3倍以上体积的完全培养液终止胰酶作用，并用吸管反复吹打使细胞脱壁。转移细胞至离心管中，并用1×PBS将瓶底洗一次，尽可能搜集更多的细胞，离心，重悬，按1：2比例接种并标记为第一代（P1），继续培养。以后约每3~4d传代一次。（四）细胞冻存和复苏将约80~90%融合的细胞消化、离心弃去上清夜，加入1ml细胞冻存液重悬后，转移细胞至无菌细胞冻存管中，密封。细胞放入冻存盒（或按4℃30min，－20℃2h将细胞转移）至－80℃冻存的细胞取出后立即放入37℃水浴2-3分钟内融化，快速转移至含4ml完全培养液的离心管中，混匀后离心，1100rpm/min,4min.离心后细胞用完全培养液重悬二、细胞与支架复合培养支架在培养液预湿过夜，接种前在无菌超净台吹至半干，用无菌镊子夹取至孔板，每孔一个支架。将已消化好的一定体积高浓度细胞悬液接种到每个支架表面，在37℃，5％CO2的恒温培养箱中静置培养3h，然后每孔加入相应培养液三、细胞形态检测（扫描电镜）细胞材料复合物培养1d后，取出用2.5%戊二醛固定4h，1%四氧化锇后固定，梯度酒精脱水10min，临界点干燥，喷金后在扫描电镜下观察细胞形态。四、细胞黏附增殖（MTT法）（一）原理MTT(噻唑兰)，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT转变为不溶于水的蓝紫色结晶并沉积在细胞内，结晶物能被二甲基亚枫（DMSO）溶解，用分光光度计或酶标仪检测490nm波长的吸光度，可间接反应细胞的数量。（二）试剂配制工作浓度：0.5g/l，可用1XPBS或未加酚红的培养基配制，宜现配先用（或半月内），4℃(三)实验步骤（1）在各时间点，细胞材料复合物用PBS洗两次，加入1mlMTT（0.5g/l）溶液，避光放入37°C,5%CO2培养箱孵育3h；（2）将复合结构移入新的Eppendorf管（避光），加入300ulDMSO,（混合器）震荡5min，离心5min（2000rpm）；（3）紫外分光光度计（或酶标仪）检测上清液490nm波长的吸光度（OD值）（1mlMTT工作液DMSO。（四）注意事项MTT及结晶溶解产物见光会快速分解，因此每一步均应避光。五．碱性磷酸酶活性测定（骨）（1）样本获取：细胞支架复合物在成骨诱导液中培养3，7，14，21d时，用PBS洗两次，加入300μl碱性磷酸酶裂解液，超声裂解4min，离心2min（13,000rpm），将上清液分装至4-5个EP管，冻存于-20℃（2）碱性磷酸酶测定：样品解冻后离心，取20μl加入200μl5mM对硝基苯酚（p-nitrophenol），立即放入37℃水浴中，15min以后，加入1ml0.02mMNaOH终止反应，紫外分光光度计检测反应物在405nm波长的吸光度（3）总蛋白测定：取30μl样品，加入150μl试剂A(一种碱性酒石酸盐溶液)，混匀后加入试剂B(一种稀释的蛋白定量试剂)，孵育15min，紫外分光光度计检测反应物在750nm波长的吸光度（总蛋白浓度）。（4）碱性磷酸酶活性计算为酶浓度与总蛋白浓度之比。六、糖胺多糖合成量测定（软骨）BMSCs接种至酰胺化PHBV支架诱导成软骨培养时，同时设置BMSCs及软骨细胞复合酰胺化PHBV支架培养作对照，将BMSCs及软骨细胞1×107cells/mL接种至相同大小的支架上。单纯BMSCs培养以低糖DMEM＋10%FBS液，软骨细胞以高糖DMEM＋20%FBS液进行复合培养。接种1周、2周及3周，分别收集三组细胞，裂解后以二甲基亚甲蓝分光法测定糖胺多糖(GAG)含量。方法如下：取500μL细胞裂解液,加入2.5mL二甲基亚甲蓝溶液(二甲基亚甲蓝16mg、甘氨酸3.04g、氯化钠2.37g、0.1mol/L盐酸95mL，加水配成1000mL溶液，调pH值为3.0)，充分混匀，用紫外分光光度仪(λ=七、冰冻切片及染色技术（一）冰冻切片技术冰冻切片是利用物理降温的方法将组织标本冷冻使其产生一定硬度进行切片的技术方法，是脂肪染色、酶组织化学染色（如碱性磷酸酶染色和阿新蓝染色等）及免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是制片简单，且能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜组织和已固定组织均可作冰冻切片。试剂及配制：0.01MPBS:4%多聚甲醛：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml0.1mol/L磷酸缓冲液（PhosphateBuffer以下简称PB），加热至60℃步骤：（1）细胞支架复合物从培养基中取出（或新鲜组织），PBS洗两次，用包埋剂覆盖后快速冻存（减少冰晶形成）在-80℃或液氮中（2）载玻片上涂少量多聚赖氨酸，干片后备用（3）组织块快速转移至冰冻切片机内，将组织切成5-10μm厚的切片，贴到准备好的载玻片上（4）干片后用4%多聚甲醛在4℃固定20min，0.01MPBS洗三次，每次5-10min。（随后进行后续的酶组织化学染色或免疫组化染色，如果暂时不染色必须吹干后放（二）冰冻切片碱性磷酸酶染色续上（5）加入BCIP/NBT染色液20min，用双蒸水洗去浮色，在显微镜下观察染色结果。(三)冰冻切片荧光免疫组织化学染色（1）切片用4％PFA室温固定20min，PBS洗三遍，每次10min。（2）0.2%TritonX-100/PBS室温处理30min。（3）山羊血清封闭30～50min。（4）去除山羊血清，不洗，直接加1:200一抗，4℃（5）PBS洗三遍，10min/次。（6）加入1：200CY3偶联的山羊抗小鼠IgG，室温孵育45min。（7）PBS洗三遍，10min/次。（8）Hoechst33342衬染细胞核10～30min。（9）荧光显微镜观察。八、石蜡切片及染色技术（一）石蜡切片制作基本技术组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。1.取材应根据要求选取材料来源及部位。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。2.固定用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。3.洗涤与脱水固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不脱尽，苯类不能浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30％或50％酒精开始，经70％、85％、95％直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。4.透明纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片，最长为数小时。5.浸蜡与包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为56～58℃或60～62℃6.切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为4～7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。7.贴片与烤片用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥，也可在378.切片脱蜡及水化干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。如果染料配制于酒精中，则将切片移至与酒精近似浓度时，即可染色。9.染色（石蜡切片苏木精-伊红HE）染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。未经染色的细胞组织其折光率相似，不易辨认。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。染色剂种类繁多，应根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法，还要注意选用适宜的固定剂才能取得满意的结果。经典的苏木精（Hematoxylin）和伊红（曙红，Eosin）染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色，简称HE染色。经HE染色后，细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。由于苏木精是带阳离子的染料，染液呈碱性，核内染色质及胞质内核糖体等物质对这种染料有亲和性，称嗜碱性；而带阴离子的染料伊红配制的染液呈酸性，对这种染料的亲和性，称嗜酸性。有时不同的组织结构还需要用特殊的染料及染色方法加以显示，称特殊染色。有些细胞组织经硝酸银浸润后，可使溶液中银离子还原成金属银或银粒附着在细胞组织上，呈棕黑色，这种性质称亲银性，而有些细胞组织本身不能使硝酸银的银离子还原成金属银，还需加还原剂才能将银离子还原，称嗜银性。步骤：（1）切片在二甲苯中脱蜡5～10分钟。（2）移入二甲苯和纯酒精（1∶1）混合液中5分钟左右（如经二次二甲苯脱蜡，此步可略）。（3）入100％、95％、85％、70％酒精，各级为2～5分钟。最后经蒸馏水转入染液。（4）苏木精染液染色5～15分钟。（5）水洗玻片上多余染液，0.5～1％盐酸酒精（70％酒精配制）分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟。（6）流水冲洗15～30分钟，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色。（7）蒸馏水短洗。（8）0.1～0.5％伊红染液染色1～5分钟，若着色困难，可在每100毫升染液中加入1～2滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。（9）依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟，在95％以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。（10）二甲苯透明（二次），共约10分钟。（11）封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固阿利新蓝染色（检测软骨）：=1\*GB3①切片脱蜡至水洗；=2\*GB3②蒸馏水洗；=3\*GB3③1%阿利新蓝染液染色10~20分钟；=4\*GB3④水洗2~3分钟；=5\*GB3⑤用1%中性红染液复染胞核；=6\*GB3⑥水洗2~3分钟；=7\*GB3⑦逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。番红O染色（检测软骨）：①切片脱蜡，乙醇浸洗，水洗；②Weigert's苏木素中浸染3分钟，水冲洗；③盐酸乙醇液(1%盐酸加70%乙醇)中分化15秒；④水洗3分钟，0.02%水溶性孔雀绿中浸染3分钟；⑤1%醋酸中摆动洗涤；⑥0.1%的番红O中浸染不超过3分钟；⑦乙醇浸洗，梯度脱水，干燥，中性树胶封片，光镜观察。石蜡切片Ⅰ型胶原免疫组化染色（检测骨）（1）石蜡切片在65℃烘烤（2）二甲苯脱蜡（3）梯度酒精水化（4）微波中低火抗原修复20min（5）0.2%TritonХ-100室温下5min（6）1%H2O2室温下15min（7）血清封闭20min（8）滴加1：200一抗，4℃湿盒孵育过夜，PBS洗涤5min×3（9）滴加生物化二抗，室温20min，PBS洗涤5min×3次（10）滴加三抗，室温20min，PBS洗涤5min×3次（11）滴加DAB显色，光镜下观察，反应时间3min，蒸馏水冲洗（12）苏木素复染（13）中性树胶封片，显微镜下观察，拍照。干细胞成骨诱导后的染色方法和步骤

碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。

以ALP为目标物的检测方法：

1

Gomori钙钴法

【染色原理】

ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

【孵育液配制】

3%β-甘油磷酸钠5ml

2%巴比妥钠5ml

蒸馏水10ml

2%

CaCl2

10ml

2%

MgSO4

1ml

【步骤】

（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。

（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。

（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。

（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。

（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。

【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。

2

偶氮偶联法：

【孵育液配制】

萘酚AS-BI磷酸盐

20mg

DMSO

0.5ml

0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH

9.2）

50ml

六偶氮副品红0.5ml

1mol/L

NaOH调PH

9-10，混合后过滤使用。

（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）

【步骤】

（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。

（2）蒸馏水冲洗。

（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。

（4）流水冲洗，晾干。

（5）甘油明胶封固。

【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。

3

碱性磷酸酶染色试剂盒法：

【作用原理】

细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。

【作用液配制】

取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。

【步骤】

（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。

（2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。

（3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。

【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。

针对钙沉积物“钙结节”的染色方法：

4

茜素红法

【作用原理】利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。

【步骤】

诱导液成分：DMEM完全培养基+地塞米松10-7mol/L+抗坏血酸50μg/ml+β-甘油磷酸钠10mmol/L，每2d换液一次。诱导第21天做茜素红染色观察钙结节的生成。90%乙醇固定10分钟，去离子水漂洗3次。

（1）培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。

（2）0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH

8.3）37℃，30min。

（3）蒸馏水冲洗，干燥，封片。

【结果】染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。

5

von

Kossa法

【作用原理】

Von

Kossa’s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。

【步骤】

（1）培养皿用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定5分钟，双蒸水冲洗3次。

（2）培养皿中加入5％硝酸银溶液1ml，将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。

（3）倒出残留的硝酸银溶液，蒸馏水冲洗3遍。

（4）培养皿中加入5％硫代硫酸钠溶液1ml，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。

（5）室温下晾干，封固。

1、VONKOSSA染色中脱水，是否仍是梯度酒精？

2、能否介绍一下茜素红S法钙染色的详细方法

谢谢！！！！！方法：1：切片常规入水。

2：茜素红染2min。

3：蒸馏水洗5-10s。

4：分化液洗15s。

5：常规脱水，透明，封固。

结果：钙

橙红，无机铁

紫色。

试剂：1茜素红S(alizarinredS)液：茜素红S0.5g加蒸馏水45ml,充分搅拌，同时加入

5ml稀释1:100的28%NH4OH,pH应为6.3-6.5，此液需保存至少一个月，方可使用。

2分化液：取10~3mol/LHCl混入到95%乙醇之中（即浓HCl1份，95%乙醇10000份）软骨细胞鉴定染色1%甲苯胺蓝配制：原液：1g甲苯胺蓝粉末+10ml70%酒精溶解（据说可保存6个月）

工作液：取上述原液1ml+9ml1%NaCl溶解，滤纸过滤（用时新鲜配制）

1%NaCl：1gNaCl+100ml蒸馏水（用时新鲜配制）

染色步骤：（1）爬片用PBS洗2次，直接用4%多聚甲醛固定于6孔板中1h或更长时间（4度）

（2）自来水洗15分钟，最好不要直接冲爬片，易脱片

（3）蒸馏水洗5分钟

（4）加1%甲苯胺蓝浸染2h

（5）去除多余染液，我觉得可以用注射器从6孔板中吸走。有人说用90%酒精的，但一定要慎重。否则时间稍长，就会将颜色洗脱。当然洗脱后仍然可以从（4）开始重复。

（6）镜下观察，满意后晾干，中性树胶封片。请教甲苯胺蓝多糖染色的原理甲苯胺蓝是一种异染染料，可将多糖类（粘液）染成红色，而其余组织呈不同程度的蓝色，这样增加了对比度。

当然其还可以染软骨、肥大细胞中的颗粒等。（红色）3、枸橼酸盐缓冲液(Citratebuffer)：

3.1储存液：

A.0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸(C6H8O7·H20)溶于1000ml蒸馏水中。

B.0.1M

RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。

要求：做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2.RT按要求做，一般不会出太大问题。

3.PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞(一)原理

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm／kgH２O),粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

(二)操作方法及注意事项

1.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备:先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15MPBS)稀释到所需浓度。

Percoll浓度(％)706050403020

比重g／ml

1.090

1.077

1.067

1.056

1.043

1.031

2.不连续密度梯度Percoll层的制备:先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

3.装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

4.离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。

5.取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。

(三)分离纯化细胞举例

1.富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化:按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的Percoll,如用10ml试管(或塑料管)分离,每层Percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×10８悬于１ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。

2.纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。

(四)人不同血细胞的漂浮密度

表人不同血细胞的漂浮密度

──────────────┬──────────────────

细胞漂浮密度│细胞漂浮密度

──────────────┼──────────────────

红细胞1.09-1.11│淋巴细胞1.052-1.077

粒细胞

│B淋巴细胞1.062-1.075

嗜酸性1.09-1.095

│T淋巴细胞1.065-1.077

嗜中性1.080-1.085│淋巴母细胞1.065-1.077

单核细胞1.050-1.066│自然杀伤细胞1.050-1.070

血小板1.030-1.060│

──────────────┴──────────────────

(五)问与答

问：请问percoll连续梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll连续梯度?

答：根据你需要的具体密度梯度决定的，根据要分离的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。也有用80％配的，不一定的。