蛋白质结合相互作用及研究方法

关于蛋白质结合相互作用及研究方法*DNA

*RNA

*ProteinCellassemblyandfunction/细胞组装与功能MessengerHeadquarterExecutorStable,DNAmutationStable/Versatile,rRNA,tRNA,mRNAVersatile,ProteinmodificationProtein-ProteininteractionProtein-Othercomponentinteraction第2页,共100页，2024年2月25日，星期天已有超过1000个物种的基因组完成测序，大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物—蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。

第3页,共100页，2024年2月25日，星期天蛋白质序列特点和结构蛋白质进化过程和保守序列蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器蛋白质表达谱蛋白质翻译后修饰情况了解与其相关联的其他细胞蛋白质蛋白质信息的不同层次蛋白质之间的相互作用是细胞进行一切活动的基础。第4页,共100页，2024年2月25日，星期天蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。

蛋白质间相互作用研究的重要性第5页,共100页，2024年2月25日，星期天Humanprotein-proteininteraction(PPI)networkTowardsaproteome-scalemapofthehumanprotein–proteininteractionnetworkRual,Vidaletal.Nature437,1173-1178(2005)第6页,共100页，2024年2月25日，星期天

错误的蛋白质相互作用可能导致疾病

如Alzheimer’sdisease,beta-淀粉样结构的堆积（alpha-synuclein与synphilin-1结合）；

Synphilin-1associateswithalpha-synucleinandpromotestheformationofcytosolicinclusions.NatGenet.1999;22(1):110-4

如尤文氏肉瘤融合蛋白（EWS-FLI1）可黏附于另一个RNA解旋A蛋白（RHA）控制基因转录。

AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FLI1interactionwithRNAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing'ssarcoma.NatMed.2009;15(7):750-6.第7页,共100页，2024年2月25日，星期天蛋白质相互作用分析研究思路一、鉴定与某个感兴趣的蛋白质相互作用的所有可能的蛋白质。（暂不考虑生理功能）二、详细描述鉴定出蛋白的生物功能及相互作用对其功能的影响。（研究尽可能接近胞内条件）三、运用高通量方法鉴定调节这种作用的关键因子。第8页,共100页，2024年2月25日，星期天等离子表面共振技术SPR免疫共沉淀Co-PIFarWesternblot串联亲和层析TAP融合蛋白沉降技术GST-PulldownInvitro酵母双杂交YeastTwo-hybrid噬菌体展示PhagedisplayInvivo荧光共振能量转移FRET蛋白质-蛋白质相互作用研究方法蛋白芯片ProteinChip细胞内共定位Cellularcolocalization第9页,共100页，2024年2月25日，星期天

Two-hybridsystem是90年代初发展起来的新方法。在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。Saccharomycescerevisiae一、酵母双杂交系统

1989StanleyField’slabpublishedthefirstreportonYeastTwo-Hybridassay.FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340(6230):245-246/sfields/yp_interactions/index.html第10页,共100页，2024年2月25日，星期天

酵母激活因子GAL4：

N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcriptionactivationdomain,AD)

DNA结合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录

。当两者单独存在时，不能激活转录；当两者在空间上充分接近时，可以启动下游基因的转录。1985MarKPatshne’slabdemonstratedmodularityofDNAbindingtranscriptionactivators.

第11页,共100页，2024年2月25日，星期天酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BD第12页,共100页，2024年2月25日，星期天诱饵蛋白（bait）BD-X与BD融合的蛋白表达载体，其表达的蛋白

靶蛋白（prey）AD-Y与AD融合的蛋白表达载体，其表达的蛋白

宿主菌株经改造的、含一个或多个报告基因的重组质粒的宿主细胞。Componentsofthesystem载体中加入进行营养型筛选的基因第13页,共100页，2024年2月25日，星期天

基因组中GAL4基因是缺失型的

基因组也不能合成ADE、HIS、LEU、TRP（因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长）改造后的酵母细胞的特点：第14页,共100页，2024年2月25日，星期天常见报告基因通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落第15页,共100页，2024年2月25日，星期天培养基类型pGADT7Amp+-LeupGBKT7Kan+-Trp单缺双缺四缺第16页,共100页，2024年2月25日，星期天酵母双杂交实验过程第17页,共100页，2024年2月25日，星期天第18页,共100页，2024年2月25日，星期天第19页,共100页，2024年2月25日，星期天第20页,共100页，2024年2月25日，星期天第21页,共100页，2024年2月25日，星期天用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。绘制蛋白质相互作用系统图谱(PPI)在药物设计中的应用酵母双杂交系统的应用现状第22页,共100页，2024年2月25日，星期天1）发现新的蛋白质与蛋白质的新功能将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。

第23页,共100页，2024年2月25日，星期天2）构建基因组蛋白连锁图（GenomeProtein-proteinInteractionMap，PPI）基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列。利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。第24页,共100页，2024年2月25日，星期天Genomeprotein-proteinInteractionmap第25页,共100页，2024年2月25日，星期天第26页,共100页，2024年2月25日，星期天第27页,共100页，2024年2月25日，星期天3）筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响

对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。第28页,共100页，2024年2月25日，星期天酵母双杂交系统的优点高敏感性

①采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；②激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；③检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。第29页,共100页，2024年2月25日，星期天酵母双杂交系统的优点高敏感性。真实性--检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。简洁性--融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。广泛性--采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质。第30页,共100页，2024年2月25日，星期天酵母双杂交系统中常见问题（一）假阳性较多（二）转化效率偏低（三）阴性干扰第31页,共100页，2024年2月25日，星期天假阳性定义在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。（一）假阳性较多

①BD融合诱饵蛋白的单独激活作用(自激活现象）②AD融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。③AD融合蛋白直接与转录因子相互作用激活报告基因；④蛋白过表达导致非生理情况下的结合原因：第32页,共100页，2024年2月25日，星期天排除假阳性的措施

①

作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。--如存在自激活，双杂交前删除该片段，但应保留相互作用的结构域②采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。--目前多数载体已采用。进一步分析：

①

这种相互作用是否会在细胞内自然发生。②有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用。③一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白也可发生相互作用。第33页,共100页，2024年2月25日，星期天酵母转化效率较细菌低4个数量级，转化成为双杂交技术的瓶颈。办法：引进酵母接合型

a接合型和接合型（两者之间可，但自身不能形成二倍体）（二）转化效率偏低第34页,共100页，2024年2月25日，星期天菌落筛选蓝白斑筛选第35页,共100页，2024年2月25日，星期天（三）阴性干扰融合蛋白的表达对细胞有毒性，该怎么办？应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。原因：第36页,共100页，2024年2月25日，星期天

酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。

双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。酵母双杂交系统使用注意事项第37页,共100页，2024年2月25日，星期天

在酵母双杂交的基础上，又发展：酵母单杂交—分析DNA和文库蛋白之间的作用酵母三杂交--分析蛋白和RNA间的相互作用酵母的反向杂交--两种蛋白相互作用的结构和位点。酵母双杂交相关技术第38页,共100页，2024年2月25日，星期天酵母单杂交系统在酵母单杂交系统中，用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点。该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gal4P的激活结构域作用可激活作为表型选择性报告基因的表达。第39页,共100页，2024年2月25日，星期天酵母单杂交系统应用①确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。②分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因。③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域。

研究DNA-蛋白质相互作用第40页,共100页，2024年2月25日，星期天酵母三杂交系统在酵母三杂交系统中，除RNA结合蛋白-BD和待选的RNA结合蛋白-AD，还需构建一杂合RNA，含有二个不同的蛋白结合位点。当RNA与二个RNA结合蛋白的结合位点相互作用时可激活报道基因的转录和表达。三杂交系统提供了快速、多用的体内检测RNA-蛋白间相互作用的新方法。。RNA第41页,共100页，2024年2月25日，星期天反向酵母双杂交系统

（reverseyeasttwo-hybridsystem）该系统是一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因。在这系统中，野生型BD-X/AD-Y间的相互作用激活一种URA3报告基因，使酵母宿主-URA（ura缺失）培养基上生长；但URA3编码的酶类可以使5-FOA变成对细胞有毒性的物质，使酵母细胞在含5-FOA的培养基上不能生长。在此情况下BD-X/AD-Y作用的解离赋予酵母一种选择生长优势。利用这种方法能方便地鉴定作用缺陷等位基因、解离肽或相关的小分子物质。第42页,共100页，2024年2月25日，星期天-Ura5-FOA这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。在含有5-FOA的完全培养基上“饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。有相互作用无相互作用++--反向酵母双杂交系统

（reverse

yeasttwo-hybridsystem）VidalM,BrachmannRK,FattaeyA,HarlowE,BoekeJD.Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions.ProcNatlAcadSciUSA，1996，93(19):10315-10320.第43页,共100页，2024年2月25日，星期天反向酵母双杂交系统的应用研究蛋白间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸，进而分析蛋白结构和功能的关系。筛选能阻止某些蛋白间相互作用的肽或小分子物质用作临床治疗制剂。利用反向双杂交系统对文库进行预清除，则可能大大减轻以后的假阳性鉴定工作。反向双杂交系统作为正向双杂交系统的补充，提出了创建整个有机体蛋白质连锁图谱的设想。第44页,共100页，2024年2月25日，星期天细菌双杂交：操作简单，周期短2-3天可研究膜蛋白或跨膜蛋白相互作用哺乳细胞双杂交：蛋白有翻译后修饰，可正确地折叠报告基因：荧光素酶，碱性磷酸酶和

-半乳糖苷酶酵母双杂交相关技术第45页,共100页，2024年2月25日，星期天Figure.Schemaofthehigh-throughputyeasttwo-hybridpipeline.Nature.2005Oct20;437(7062):1173-8.Towardsaproteome-scalemapofthehumanprotein-proteininteractionnetwork.Example第46页,共100页，2024年2月25日，星期天theleaderinenzymetechnology二、噬菌体展示技术是一项筛选技术，将目标蛋白的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面。被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基因III中，并与pIII蛋白融合展示。

SmithGP.Science1985;228:1315-7/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDisplayWebsiteIndex.html第47页,共100页，2024年2月25日，星期天展示系统不同分为：M13噬菌体展示系统、T7噬菌体、T4噬菌体与

-噬菌体展示系统噬菌体展示系统的分类：丝状噬菌体蝌蚪形噬菌体λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体M13噬菌体第48页,共100页，2024年2月25日，星期天展示内容（文库）不同包括：随机肽段文库、天然肽段文库、cDNA文库、抗体文库（抗体片段）、蛋白质文库等噬菌体展示系统的分类：第49页,共100页，2024年2月25日，星期天theleaderinenzymetechnologyLifeCycleofM13

以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA。

基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白质。与展示密切相关的有两种结构蛋白质（主要衣壳蛋白pVIII和次要衣壳蛋白pIII）。

感染宿主后通常不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中（37oC）。感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体。第50页,共100页，2024年2月25日，星期天theleaderinenzymetechnology主要衣壳蛋白pVIII和次要衣壳蛋白pIIIPIIIPVIII展示多肽～300aa<10aa展示数量低价（约5个拷贝）高价（高达2700个拷贝）配体结合力亲和力非常低高亲和力插入部位N端、近N端或N端与C端的柔性连接区融合N端或近N端融合衣壳蛋白第51页,共100页，2024年2月25日，星期天GeneralselectionschemeforcDNAexpression-productsdisplayedonphagesurface.Konthuretal2003TARGETSVol.2,No.6261-270.噬菌体展示操作流程第52页,共100页，2024年2月25日，星期天噬菌体展示技术的优点非展示系统展示系统第53页,共100页，2024年2月25日，星期天噬菌体展示技术的优点特定分子的基因型和其表型统一在同一个噬菌体颗粒内，将重组蛋白质筛选与基因筛选合二为一。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。淘选的高效率使阳性克隆在微量存在的情况下，通过感染得到扩增富集。操作简单易行，在几周内即可筛选106～108克隆噬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩增等突出优点。第54页,共100页，2024年2月25日，星期天噬菌体展示技术的局限性所建库的容量（109）和分子多样性受到限制；噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。少数多肽由于疏水性，或由于影响外膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。第55页,共100页，2024年2月25日，星期天噬菌体展示的应用••••抗原表位分析蛋白质相互作用位点的确定人工抗体和疫苗的制备酶抑制剂的研究开发多肽药物的研制第56页,共100页，2024年2月25日，星期天TargetingPlasmodiumligandsonmosquitosalivaryglandsandmidgutwithaphagedisplaypeptidelibraryProcNatlAcadSciUSA.2001;98(23):13278–13281.Figure1.Schematicillustrationoftheselectionprotocolforphagesthatbindeithertosalivaryglands(a)ortotheluminalsideofthemidgutepithelium(b).Example第57页,共100页，2024年2月25日，星期天三、荧光共振能量转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)

当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。FRET技术是目前唯一能对固定细胞中的蛋白质间相互作用或存在于活细胞蛋白质间相互作用，提供定位和定量信息的技术。第58页,共100页，2024年2月25日，星期天FRET荧光能量转移第59页,共100页，2024年2月25日，星期天FRET荧光能量转移有三个基本条件：给体与受体在合适的距离（1～10nm）；给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）；给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。第60页,共100页，2024年2月25日，星期天

1)荧光蛋白:

一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体。

BFP/GFP,CFP/YFP.

常用的探针

ColordefiningGFPBlue(BFP)Green(GFP)Cyan(CFP)Yellowish(YFP)Red(D.s.RFP)Excitation(max)382nm434nm488nm514nm558nmEmission(max)446nm476nm509nm527nm583nmSensitivitytophotobleachingHighLowLowModerateLow第61页,共100页，2024年2月25日，星期天

2)传统有机染料:

具有特征吸收和发射光谱的有机化合物组成的染料对。包括荧光素和青色染料Cy3/Cy5等。（优先选择）

3)镧系染料:

稀土染料,一般与有机染料联用，分别作为FRET的供体和受体，以提高检测的准确性和信噪比。

4)量子点:

量子点是一种能接受激发光产生荧光的纳米颗粒。激发和放射光谱宽，

发射荧光强（20倍），稳定（100倍）。常用的探针

第62页,共100页，2024年2月25日，星期天FRET常见的供体-受体荧光分子对：荧光蛋白类：染料类：CFP-YFPBFP-GFPBFP-YFPCFP-DsRFPGFP-DsRFPCFP-YFP-mCherry第63页,共100页，2024年2月25日，星期天均相检测（无分离和洗涤步骤）实时连续地观察活细胞的动态变化FRET技术的优势和缺点FluorescenceIntensityTime

LigandCy3Cy5荧光强度随时间衰减，有时间限制；采集信号有噪音缺点：第64页,共100页，2024年2月25日，星期天

假阴性问题

转染效率，尤其是目标蛋白是膜蛋白时配对的供体和受体之间距离和方向不合适，即便形成复合物，FRET也不会产生；

仪器的敏感度、分辨率、及影像采集和分析能力

假阳性的问题

没有相互作用的供体和受体之间相隔很近的话，也可以发生FRET；

所以，应结合多种蛋白相互作用的研究方法（如免疫共沉淀）

FRET荧光能量转移应注意问题：第65页,共100页，2024年2月25日，星期天FRET应用范围

酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证蛋白质—核酸相互作用酶活性分析 离子通道研究蛋白质的结构研究第66页,共100页，2024年2月25日，星期天TechniqueExtension-

Bimolecularfluorescencecomplementation

(BiFC,双分子荧光互补技术)

AVisualSystemtoInvestigateProtein-ProteinInteractionsBiFC技术是将荧光蛋白（GFP、YFP、CFP）分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，对研究蛋白质相互作用有重要意义。Huetal.,Mol.Cell9,789–798(2002).第67页,共100页，2024年2月25日，星期天可以在最接近活细胞生理状态的条件下观察到相互作用的蛋白发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等。第68页,共100页，2024年2月25日，星期天四、细胞内共定位实验

(Cellularlocalization)直观，可以看到两种有相互作用的蛋白质在细胞内的分布以及共定位的部位

蛋白质细胞内定位结果较为直观地反应蛋白在细胞内的活动状态

第69页,共100页，2024年2月25日，星期天有色荧光蛋白标记技术步骤也可称为活细胞定位分别克隆X，Y至荧光蛋白载体中共转染表达GFP/RFP融合蛋白confocalmicroscopy共聚焦显微镜法第70页,共100页，2024年2月25日，星期天第71页,共100页，2024年2月25日，星期天检测细胞内源性蛋白的定位及相互作用一抗，二抗（荧光素标记）“靶蛋白一抗二抗”免疫复合物对照的严格设置利用双色或多色染色的免疫荧光技术进行蛋白定位步骤第72页,共100页，2024年2月25日，星期天第73页,共100页，2024年2月25日，星期天其它研究方法的基本原理第74页,共100页，2024年2月25日，星期天五、融合蛋白沉降技术

(如：GSTPulldown)

利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。第75页,共100页，2024年2月25日，星期天GSTpulldown第76页,共100页，2024年2月25日，星期天一确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用；一是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。融合蛋白沉降技术的应用第77页,共100页，2024年2月25日，星期天

操作简便，如果用抗GST抗体检测或生物素标记融合蛋白避免了使用同位素等危险物质。

融合蛋白具有高通量性、高选择性的特点，由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性(如细菌、果蝇、哺乳动物)，该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用。

融合蛋白沉降技术的优点第78页,共100页，2024年2月25日，星期天该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多，并且保持蛋白质活性的重组融合蛋白。

只用于确定体外的相互作用，还应当在体内用单独的方法，如免疫共沉淀加以证实。

此方法常用来验证酵母双杂交试验所得到的相互作用。融合蛋白沉降技术的局限性第79页,共100页，2024年2月25日，星期天

利用抗原抗体作用的专一性为基础。可用于鉴定两种兴趣蛋白质是否在体内存在相互作用；也用于鉴定一个特定蛋白质的未知相互作用蛋白。六、免疫共沉淀技术Co-immunoprecipitation(Co-IP)第80页,共100页，2024年2月25日，星期天免疫共沉淀YABAYBY非生理性结合生理性结合非特异性结合原理：细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。第81页,共100页，2024年2月25日，星期天实验的关键1、

实验最需要注意点就是抗体的性质。2、为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须使用蛋白酶抑制剂，低温下(4C)进行实验。合理设置对照，避免非特异性结合。使用对照抗体：鼠单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG第82页,共100页，2024年2月25日，星期天优点：1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；缺点：1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质相互作用；2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，可能有第三者在中间起桥梁作用；

3、如用westernblot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体。免疫共沉淀技术的优缺点第83页,共100页，2024年2月25日，星期天PlasmidsconstructTranscription;Translation;MixtranslatedproductsIncubationwith

ONEantibodyElutionandseparationwithSDSAnti-cMycAnti-HA用免疫共沉淀(Co-IP)技术验证酵母双杂交获得的结果第84页,共100页，2024年2月25日，星期天1999年Rigaut等人共同提出了一套分离复合蛋白的新方法—串联亲和纯化(Tandemaffinitypurification，TAP)，兼具标准亲和纯化（可以得到高纯度地拷贝数的蛋白质复合体）和免疫共沉淀（用于特异性的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用）两种生化方法的优点，为蛋白质复合体的分离鉴定提供了一条新路径。

适用于：研究蛋白质复合体中多个蛋白质间的相互作用，特别适用于研究蛋白质在生理条件下的相互作用七、串联亲和层析TAP第85页,共100页，2024年2月25日，星期天RigautGetal.,NatureBiotechnology17,1030-1032(1999)串联亲和层析靶蛋白结合于IgG珠子充分洗涤后，在TEV蛋白酶作用下洗脱结合物钙离子存在下，将首次洗脱物中的蛋白质结合于钙调蛋白包被的珠子上充分洗涤后，加入EGTA洗脱结合物第86页,共100页，2024年2月25日，星期天TAP中常用标签第87页,共100页，2024年2月25日，星期天

TAP优点：1、相互作用发生在天然环境和细胞部位，可以分离和分析多组分的复合物。2、标签的高度特异性以及采用两步洗脱纯化法，可以更好地保持较不稳定的蛋白质复合物，降低非特异蛋白的结合。3、步骤简单、可量化、可获得大量蛋白质。TAP缺点：1、倾向于分离高丰度和稳定的相互作用蛋白，许多低亲和力、瞬时和依赖特殊细胞环境的相互作用可能检测不到。2、必须采用TAP标签的蛋白，在哺乳动物细胞中，高于生理水平的诱饵蛋白而产生假阳性。

第88页,共100页，2024年2月25日，星期天TAP与质谱结合（TAP-MS)第89页,共100页，2024年2月25日，星期天核糖体蛋白代谢酶类热休克蛋白泛肽酶高丰度的细胞骨架蛋白血清蛋白（如果使用是IP亲和的方式）MSafteraffinitypurification鉴定结果中通常包含很多非特异的蛋白质信息去除这