生物显微技术课件

石蜡切片的制作石蜡切片的过程动物的处死动物组织取材固定组织固定后的处理脱水和透明包埋切片一、动物的处死麻醉空气栓塞颈椎脱臼或断头股动脉放血二、动物组织取材动物组织取材原则：尽量保持组织的生活状态。动作要快不要过度用力夹捏组织，防止组织变形。三、固定1、目的：尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后变化、自溶。保持细胞和组织原有的形态结构，保持组织内部成分特征不发生变化。2、方式：浸入式灌注式灌注式此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。然后取材，投入固定液。灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。3、固定液醛类固定剂非醛类固定剂丙酮及醇类固定剂醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联。包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛通常与其他的试剂联合使用优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保存蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不着色，并且产生“福尔马林色素”，它是由于血红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。非醛类固定剂氯化汞（HgCI2）：蛋白的强固定剂重铬酸钾：保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂，醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态。四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用与电镜观察切片的固定与染色。丙酮及醇类固定剂丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可以单独使用，低温下保持酶活性效果好。乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他试剂混合使用，单独使用使组织收缩严重，对细胞形态保存不良。混合固定剂固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4成分：4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸缓冲液中，1倍的磷酸缓冲液:PBSMV

NaCl140mM58.44KCl2.7mM74.55NaH2PO4•12H2O，10mM358.14KH2PO4

1.8mM

136.09调pH至7.4。

Bouin’s液苦味酸饱和水溶液75ml15固定糖原37%-40%福尔马林液25ml5固定蛋白和脂肪冰醋酸5ml1凝固核染色质固定组织时应注意：①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。②组织块不易过大过厚，必须小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。固定时间的选择不同的研究目的所需使用的固定液。材料的大小，组织的特性与致密度。温度的不同有所差别。组织固定后的处理冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。修块:大小合适、去除形态不好的部分，四、脱水脱水目的：运用某种溶剂置换组织内的水分。脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等乙醇：最常用的脱水剂一般组织：70%---80%----90%--100%---100%特殊组织：30%--40--%--50%---60%---70%---80%---90%--100%---100%每步30分钟左右。要求：完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间

不能过度脱水（使组织变脆）不同组织脱水时间不同：大的致密的组织需要延长脱水时间为加速各级酒精的穿透力，脱水可在37℃温箱中进行。

五、透明或媒浸目的与作用对组织的最后脱水处理与包埋剂置换透明剂：苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂100%乙醇脱水后进入二甲苯两次，保证透明完全。六、包埋包埋剂的特点：具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。能完全进入组织。对组织内部成分损伤小。石蜡包埋石蜡特点：熔点：45-50℃软蜡55-60℃硬蜡常用石蜡的处理：新蜡应溶一次，增加密度。并用滤纸过滤去处杂质。加5%~10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。反复溶的旧蜡包埋效果更好。程序：在溶蜡箱中进行55-60℃，恒温。浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（1：1）中两次，在石蜡中两次，每次一个小时左右。包块：在室温进行七石蜡切片载玻片处理：切片：展片：背面与玻片。烘片：37℃的温箱内烤干(约需12小时)。优点：操作比较简便、容易，可以切出较薄的切片，并且易于制成连续切片，也容易附着于载玻片上。缺点：是不适于较大的标本，材料在经过脱水、浸蜡的过程中容易收缩。火棉胶切片法透明剂：乙醚与乙醇等量混合包埋剂：火棉胶溶于透明剂包埋：常温进行凝固：在乙醚中过夜，在氯仿中过夜。在70%乙醇中保存。优点：可切大的组织可切较硬的组织如硬骨缺点：操作所用时间长一般切片厚度为20-30μm。不能连续切片全部试剂为易燃物质，注意防火冰冻切片法取材：液氮保存载玻片处理切片保存：-70℃或-20℃染色活体染色：无毒染料注入动物体内，一定时间后取材，固定切片或铺片观察台盼蓝，台盼红，墨汁。固定后染色：媒染剂：组织—媒染剂---染料复合体。增强剂：加强染色的选择强度。加速剂：加强染料的渗透作用。苏木精(hematoxylin)、伊红（eosin）染色法（ＨＥ染色）苏木精将细胞核染成紫蓝色，伊红将细胞质（浆）染成红色。苏木精是具有阳离子的碱性染料，可以与具有阴离子基因的组织成分耦合成盐，凡组织结构对苏木精起紫蓝色反应的称为嗜碱性（basophil）。伊红是具有阴离子的酸性染料，可以与具有阳离子基因的组织伊红起红色分耦合成盐，凡组织结构对伊红起红色反应的称为嗜酸性（acidophil）。对碱性或酸性染料亲和力均不强者，则称为中性。Delafield苏木精液苏木精4g无水乙醇25ml（溶解）10%铵矾水400ml，甘油100ml，甲醇或95%乙醇100ml。阳光空气中放3-4个月石蜡切片苏木精染色步骤切片脱蜡：二甲苯两次，每次10-20分钟。梯度酒精下行入水：100%--90%--80%--70%--60%--50%--水苏木精染色10分钟左右，水洗。分色：1%盐酸的70%乙醇中。使核着色，核以外的成分无色。水洗。1%伊红的70%酒精复染1分钟95%乙醇分色

95%乙醇漂洗，无水乙醇脱水。无水乙醇：二甲苯=1：1一次二甲苯两次加胶封片ＨＥ染色结果细胞核蓝紫色，细胞质、胶原纤维、肌纤维呈不同色调的粉红色。进行性染色：退行型染色：分色

组织化学定义组织化学也称细胞化学，是在组织的原位上显示并研究其化学性质和功能关系的一门科学技术。组织化学是细胞形态学与化学、生物化学之间的边缘科学。根据已知的化学反应，在细胞原位上以化学反应显示出该细胞中的化学成分、性质、及其变化，从而将结构和机能更紧密的联系在一起。借助这一技术可以：直接观察到细胞的形态特征；可以观察到该细胞的化学成分、化学性质；在不同生理状态下，组织形态、化学性质的变化研究可以阐明细胞的功能。组织化学的技术要求保存细胞的生前结构。保存细胞生前的化学成分和酶活性。所用的化学方法是已知的化学反应，具有高度的特异性。反应产物应是一种能形成稳定沉淀的有色物质，供光镜观察；或电子密度高的物质供电镜观察。组织化学的特点定性定位相对定量研究细胞或组织中的化学物质。研究内容蛋白质：酶类、抗原等具有某种特异功能的蛋白。核酸：DNA和RNA糖类脂类无机盐和微量元素糖类显示最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应（periodicacidSchiff，PAS反应)。基本原理是：糖被强氧化剂过碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结合，形成紫红色反应产物,PAS反应阳性部位即表示多糖的存在。

脂类显示

脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹Ⅲ、苏内Ⅵ、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色；亦可用饿酸固定兼染色，脂类呈黑色。核酸显示显示DNA的传统方法为Feulgen反应。切片先经稀盐酸处理后，使细胞内DNA水解，打开DNA分子中胶氧核糖核酸和嘌呤碱之间的连接按键，使其释放出醛基，再用Schiff试剂处理，形成紫红色反应产物。

如用甲基绿-派若宁反应，可同时显示细胞内的DNA和RNA甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色。分类一般组织化学它的基本原理是在组织切片上滴加一定试剂，使它与组织细胞内某种化学物质起反应，并在原位形成有色沉淀产物，通过观察该产物，可对某种化学物质进行定位、定性及定量的研究。荧光组织化学它的基本原理是用荧光显微镜以短光波紫外线作光源，紫外线可激发标本内的荧光物质，使其呈现荧光图象，借以了解细胞组织中的不同化学成分的分布。免疫组织化学是近年来发展起来的新技术。它的基本原理是利用抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞中某种肽类及蛋白质等大分子物质的分布酶类的显色方法酶的分类水解酶氧化还原酶转化酶连接酶裂解酶异构酶酶的组织化学反应偶氮染料法吲哚酚法金属盐法氧化-还原反应碱性磷酸酶钙-钴显示法原理：RPO3-------ROH+H3PO42H3PO4+3Ca(NO3)2----Ca3(PO4)2+6HNO3Ca3(PO4)2+

3Co(NO3)2----Co(PO4)2+3Ca(NO3)2Co(PO4)2+3(NH4)2S----3CoS+2(NH4)3PO4碱性磷酸酶作用液(pH9．3)溶液1：2％甘油磷酸纳

2％巴比妥纳

2％硝酸钙

2％硫酸镁(或氯化镁)

蒸馏水溶液2：1％硝酸钙。溶液3：1％硝酸钻。溶液4：1％硫化铵(临用时现配)方法切片脱蜡入水入碱性磷酸酶作用液作用2h，但在切片入作用液前，应将作用液置37c温箱中30min(注意：对照片在作用液内免去甘油磷酸钠，或进作用液前，放在沸水中煮7—8min)。过蒸馏水一次，浸入1％的硝酸钙中2-3min。过蒸馏水一次，浸入1％的硝酸钴中2-3min。蒸馏水洗1mm，人1％硫化铵1-2min。自来水冲洗5—6min。经上行乙醇脱水．在伊红中染色20-30秒，经100％酒精两次，二甲苯两次透明。免疫组织化学免疫组织化学ImmunocytochemistryICC免疫组织化学免疫细胞化学又称免疫组织化学、其主要原理是用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。免疫细化学的基本理论抗原抗体反应标记化学反应显色化学反应抗原抗体反应抗体是免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）。人类免疫球蛋白有五类，即IgG、IgA、IgM、IgD及IgE。人体内的五类Ig之间的区别就在于其各自重链的氨基酸组成和抗原性不同。用小写希腊字γ（Gamma）、α(Alpha)、μ(Mu)、δ(Delta)、ε(Epsilon),分别表示IgG、IgA、IgM、IgD与IgE的两条重链。免疫组织化学特点1.高度特异性2.敏感性高3．方法步骤统一4．形态、机能和代谢密切结合基本技术方法抗体的制备组织材料的处理免疫染色对照试验显微镜观察免疫组织化学分类根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为:免疫荧光细胞化学技术免疫酶细胞化学技术亲和免疫细胞化学技术免疫电子显微镜技术免疫酶细胞化学预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。酶的种类辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP）碱性磷酸酶（Alkalinephasphotase,ALP）葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,GOD）酶的要求酶催化的底物必须是特异、容易观察；定位效果好；易获得，最好有商品出售；酶的催化活性（Turnover）高并且稳定；酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性；背景低：被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。基本步骤组织及切片制备抗体的制备切片封闭：血清等与抗体孵育加入显色底物显色复染观察抗体制备酶标抗体酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体。再借酶对底物的特异催化作用显色。非标记抗体酶法酶桥法抗过氧化物酶法（PAP）PAP法的评价抗体活性高灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。背景染色低：亲和免疫细胞化学技术物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。抗原与抗体植物凝集素和糖类生物素与抗生物素葡萄球菌A蛋白与IgG阳离子与阴离子

激素和受体等亲和免疫细胞化学技术特点亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使其敏感性得到进一步提高，因此更有利于微量抗原（或抗体

）在细胞或亚细胞水平的定位。

抗生物素—生物素免疫细胞化学染色法

基本原理

生物素（Riotin）：是一种小分子的维生素卵白素（Avidin）：又名亲合素，鸡蛋白中一种碱性蛋白。生物素与卵白素之间有很强的亲合力，较之抗体对抗原的亲合力要高出100万倍，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合的能力。

抗生物素—生物素染色法

1．抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术（AvidinBiotin–PeroxidaseComplextechnique,简称ABC技术）2．桥抗生物素—生物素技术（BridgedAvidin–Biotintechnique,简称BRAB技术）3．标记生物素—抗生物素技术（LabelledAvidin—Biotintechnique,LAB技术）

桥抗生物素—生物素技术（BridgedAvidin–Biotintechnique,简称BRAB技术）

一抗：生物素标记的特异性抗体二抗：卵白素三抗：生物素标记的酶

操作步骤固定：生物素标记的第一抗体，室温孵育15min。PBS洗5min，更换3次。第二抗体卵白素，孵育15min。PBS洗5min，更换3次。生物素标记的酶孵育作用15min。PBS洗5min，更换3次。显色。复染封片、观察。标记生物素—抗生物素技术（LabelledAvidin—Biotintechnique,LAB技术）

一抗：生物素标记的特异性抗体二抗：酶标记抗生物素切片在含有25～50μg/ml生物素标记抗体（PBS液稀释）中孵育1h，室温。PBS洗2次，每次5min。用20～50μg/ml过氧化物酶标记的抗生物素液孵育90min，水洗。酶呈色反应。设计对照实验设计对照实验目的：证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照。①阳性对照；②阴性对照；阳性对照用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。阴性对照没有信号出现的检测结果。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果；用没有交叉反应的抗体代替特异性抗体进行实验。用特异性抗体的抗血清与特异性抗体与切片共同孵育；免疫细胞化学结果的判断判断特异性染色和非特异性染色。要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验。重复免疫组化检测action蛋白在大鼠卵巢组织中的表达。请选择抗体组合，设计实验。人抗大鼠action（同种型IgG）大鼠抗人action（同种型IgG）

兔抗大鼠action（同种型IgG）

生物素标记的兔抗人IgG生物素标记的兔抗人IgM生物素标记的人抗兔IgG生物素标记的人抗兔IgM碱性磷酸酶标记的卵白素碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG原位杂交组织化学

核酸分子杂交技术

固相杂交:菌落原位杂交（colonyinsituhybridization）斑点杂交法（Dotblot）Southern印迹杂交（Southernblot）Northern印迹杂交（Northernblot）组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）

液相杂交定义：特定标记的已知序列的核酸作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对标记的探针进行检测的方法称为原位杂交。DetectionofDNAbynucleicacidhybridization

分类核酸探针标记方法：放射性探针：32P3H35S非放射性探针：生物素、地高辛探针的核酸性质不同：DNA探针：单链DNA（Singlestranded,ssDNA）和双链DNA（Doublestranded,dsDNA）cDNA探针：complementaryDNAprobecRNA探针：complementaryRNAprobe寡核苷酸探针原理探针标记：同位素标记和非同位素标记的探针（生物素标记和地高辛标记）探针与靶序列根据碱基互补配对原则特异性结合检测标记的探针：放射自显影、荧光检测和酶法检测。优点不需要从组织中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性。能够完整的保持组织和细胞的形态，能更准确地反映组织细胞的功能状态以及功能上的相互联系。应用

特定的核酸序列在染色体中的精确定位。与细胞内的RNA杂交观察该基因的定位、定量表达。用特异性的细菌或病毒的核酸作为探针对组织或细胞进行杂交，以确定有无病原体的感染。原位杂交流程探针的标记取材切片:石蜡切片冰冻切片杂交前预处理杂交杂交后洗去未结合的及非特异性结合的探针探针的检测探针的标记缺刻平移法标记DNA探针DNANicktranslationDNARandomprimedlabelingRNAprobelabeling

原位杂交条件的选择增强组织的通透性和核酸探针的穿透性TritonX-100消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等消化乙酰化：浸入乙酸酐和三乙醇胺中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。

杂交杂交的温度Tm：能使50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链温度或融解温度（meltingtemperature,简称）。Tm相关因素：CG含量；核酸的匹配程度；

DNA探针：Tm是90℃，RNA探针：Tm是95℃。

甲酰胺可降低杂交Tm：反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。

高盐可降低Tm值苛刻复性温度：Ts=Tm–(10或15℃)非苛刻复性温度：Tns=Tm–(30或35℃)Tm＝79．8一D十0.584×％GC十16×lg[Na＋]一F×(％formamine)一LD：是用来校正各种不同类型杂交体热稳定性的差别系数。DNA：DNA10DNA：RNA5RNA：RNA0％GC：杂交体中G十C碱基的百分比。[Na＋]：杂交液中单价阳离子的摩尔浓度。F：是由甲酰胺引起的Tm下降常数，在DNA：DNA、DNA：RNA和RNA：RNA杂交中，F值分别为0.65、0.5和0.35。(％formamine)：杂交液中甲酰胺的百分比浓度。L用以校正双链长度对Tm的影响。杂交体双链的热稳定性随着其长度的缩短而降低。L值可用公式计算：L＝B／I。其中B＝300十2000[Na＋](Na＋应为0.05一0.5mol)，I为双链的长度，用bp表示。杂交的温度时间：16－20小时探针的浓度：应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度。杂交后处理洗涤RNAase消化并洗涤使用地高辛标记的RNA探针的冰冻切片的原位杂交实验准备玻璃仪器的处理：洗液、碱过夜、自来水、蒸馏水、180℃灭菌6小时。塑料器皿的处理：DEPC处理药品的配制：药品专用、必要时DEPC处理载片的处理：清洁如玻璃仪器硅化处理：多聚赖氨酸处理探针的标记根据被检测基因的cDNA序列设计合成引物RT-PCR的方法得到扩增产物回收扩增产物克隆到质粒载体测序使用地高辛标记的d-UTP应用体外转录系统转录合成标记的RNA探针取材：根据需要把材料切成3-5mm的小块迅速投入，液氮中，-70ºC保存。切片：10µM，-70ºC保存室温干燥30分钟或50ºC、2min固定：4%