黄芪甲苷对肺纤维化小鼠病理形态的影响

黄芪甲苷对肺纤维化小鼠病理形态的影响摘要：目的：黄芪甲苷是黄芪中众多成分的重要组成部分。研究黄芪甲苷对肺纤维化小鼠的治疗效果，提高世界人民健康水平。方法：将从实验动物公司买来的90只健康雌性小鼠分为空白对照组，模型组（BLM），黄芪甲苷药物特定浓度治疗组。造模使用鼻腔滴注博来霉素(BLM)，博莱霉素造模之后的模型组使用一定浓度生理盐水灌胃来模仿治疗，治疗组采取黄芪甲苷（AstragalosideIV）灌胃28天，三组同样分别于造模治疗后的第7天、第14天和第28天取材，通过石蜡切片制作的动物组织切片，通过生物显微镜拍照HE，MASSON两种染色方式的结果分别观察治疗组，空白组，模型组的镜下改变说明最终干预结果。结果：空白小鼠的肺组织无明显变化，模型组出现肺组织病理性改变，黄芪甲苷治疗组明显轻于模型组；黄芪甲苷治疗组小鼠活力皮毛柔顺度显著优于模型组；结论：黄芪甲苷【AstragalosideIV】对BLM造模肺纤维化【PF】小鼠有治疗、康复减轻损害的作用。关键词：黄芪甲苷；小鼠肺纤维化；BLM；PathomorphismEffectofAstragalosideⅣonPulmonaryFibrosisinMiceStudent:WuPingGuidingteacher:LuanZhi-huaAbstract:ObjectiveToinvestigatethetherapeuticeffectofastragalosideonastragalusmembranaceusinbleomycin-inducedpulmonaryfibrosisinmice,,modelgroupandAstragalosideIVtreatmentgroup.TheratsinthetreatmentgroupweretreatedwithastragalosideIV,andtheratsinthetreatmentgroupweretreatedwithbleomycin(BLM).TheanimaltissuesectionsmadebyparaffinsectionwerephotographedbyelectronmicroscopeforHE,andtheresultsoftwoMASSONstainingmethodswereobservedrespectivelyinthetreatmentgroup,intheblankgroupandinthemodelgroup,theresultofthefinalinterventionwastheresultofthefinalintervention.ConclusionAstragalosidehasatherapeuticeffectonpulmonaryfibrosismice.Keywords:AstragalosideIV;pulmonaryfibrosismice，BLM前言肺纤维化(pulmonaryfibrosis，简称PF)，这一疾病是由很多种原因所引起的一种严重的晚期的疾病。PF早期发病以呼吸道炎症和肺泡炎反应等方面为主，这个病理过程包括肺泡的上皮细胞(alveolarepithelialcells，AECs)损伤、炎性细胞的浸润、成纤维细胞在肺中激活、聚集、增多等，继而发生肺组织的病理性修复、正常结构的病理性改变，成纤维细胞聚集，最终发生肺纤维化[1]。该疾病多发现于50到70岁之间的人群，男性多于女性，经确诊后平均能寿命约2到3年，5年内生存率极低，据有关报道肺纤维化患者生存率低于癌症患者，通常最终发生死亡[2]。PF已经严重威胁我国人类健康。肺纤维化按照传统中医的辩病的思路去推理论证并结合临床实际这一疾病应该被归属于中医“肺痿”范畴[3]。‘’肺痿‘’这一术语名称本是中医流传下来，实际上并不与肺纤维化相等同。现代医学认为这种疾病是一种慢性虚损性疾病发生到中晚期的结果。祖国传统中医学对于肺痿的治疗主要考虑其摄生不当并且同时外邪犯肺，日久不愈，津液耗伤，肺叶痿弱不用，肺纤维化这一疾病临床表现主要是气短或咳嗽、长期不愈。病位在肺，久之及脾肾，肺叶枯萎。黄芪味甘，归脾、肺、肾经并且性微温。黄芪是作为肺萎疾病中伴有脾肺气虚的患者中经常使用的药材，因而在临床上防治肺纤维化起着重要作用。同时是黄芪品质定量的标志性物质，其具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗纤维化等作用[4-6]。利用黄芪甲苷的这些提升免疫的治疗作用，本实验旨在探究黄芪中的甲苷对肺纤维化PF的小鼠是否有治疗或减缓作用。1.材料1.1实验动物健康而且活泼的雌性ICR小鼠若干只，体重【19g左右】，北京维通利华动物有限公司提供，合格证号：11400786370，许可证号：SKJXK【京】2015-0005。1.2实验仪器干燥箱-培养箱【型号规格：PH-24670ADX上海一恒仪器有限公司】；恒温水浴锅【型号：HHS-234781-878上海博迅有限公司】；超声波清洗机【型号：SB-52780560DT宁波新芝科技有限公司】；电热恒温鼓风干燥箱【型号：DHG-9243345BS-III上海新苗器械有限公司】；海尔冰箱【型号：BCD-2252WDDCBD青岛海尔有限公司】；医用离心机【型号：低速离心机L53534-1长沙高新技术开发仪器有限公司】；电子天平【上海天美科学有限公司】；徕卡包埋机（型号：HistoCoreArrrcadiaH）；冷冻台（型号：HistoCoreArrrcadiaC）；石蜡切片机（型号：LEICARM452235）；恒温展开台（型号：LEICAHI121210）；烘干台（型号：LEICAHI123220）；生物显微镜（OLYMPUS）。1.3实验试剂及药物注射用博来霉素【批号：15014311规格：1.5万BLM单位，辉瑞制药】；0.9%氯化钠注射液【规格：500ml:4.5g，批号：1506263203，第四制药有限公司】；4%多聚甲醛固定液【规格：500ml，生产批号：11I22C68，武汉博士德有限公司】；黄芪甲苷【AstragalosideIV】【规格：HPLC≥98%，编号：CHB-H-0905，CAS号：8893207-58-3，成都克洛玛生物有限公司】；羧甲基纤维素钠【规格：250g，天津光复化工研究所】；无水乙醇（生产批号：20170720，规格：500ml，天津化工有限公司）；二甲苯（批号：2017052081，规格：500ml，天津市科技发展有限公司）；无毒环保苏木素染液（生产批号：20170407，规格：500ml*1，南京日上有限公司）；伊红Y染色液（水溶性）（生产批号：20178900826，规格：500ml，北京精细化学品有限公司）；Masson染液（生产批号：20170811，规格：50ml，南京建成科技有限公司）；中性树胶（生产批号：20140508，规格：100g，上海懿洋有限公司）；石蜡；蒸馏水。2.方法2.1分组造模及给药将实验所用的动物先喂养7天适应环境，随后将其随机分为3组，空白组，模型组，治疗组，每组30只，然后给小鼠鼻腔滴注博来霉素进行造模[7]，经过BLM造模后的第二天开始执行治疗：黄芪甲苷治疗组每天一次进行灌胃7、14、28天，相同时间，同样方式给空白组和模型组小鼠每天一次灌胃0.9%的同等治疗组剂量的生理盐水7、14、28天，使用此方式使小鼠经历相同或类似，每天相同操作一次。【在实验室中用0.5%的羧甲基纤维素钠和0.9%的生理盐水作为助溶剂进行灌胃配制，将黄芪甲苷配制成浓度为25mg/kg的混悬液，放在冰箱4℃储存，在灌胃前30分钟取出备用放置常温后使用】。2.2样品采集分别在连续给药后的7、14、28天后每组取材5只处死取出双肺进行拍照观察，左肺放入4%多聚甲醛固定液中，然后进行病理切片。2.3检测指标及方法2.3.1HE原理：HE染液中主要的染色剂有苏木素和伊红两种。苏木素通常主要使细胞核内的染色质、核酸等一系列呈酸性的组织着紫蓝色；伊红这种染液它主要使碱性的组织成分着红色。染色结果：在我们的HE染色时细胞核因为显酸性所以被染成蓝紫色，细胞质、肌纤维和胶原纤维或钙盐通常显弱碱性，根据不同组织的特性或酸碱性的不同被染成深浅不一的红色。2.3.2Masson原理：马松染色利用两种或三种阴离子染料混合之后分别在不同的时间作用于被染色组织而完成染色。染色液的pH值也可以影响染色反应，因此染色过程中，要注意维持染液pH值得稳定。在我们的染色中的组织，胶原纤维对阴离子染料渗透性最大最易被染为蓝色且较难褪色，次之的是肌纤维和胞质。结果：肺组织中的胶原纤以及维各种粘液和气管支气管中的软骨通常被染液染为蓝色，组织细胞中的细胞浆、肌肉纤维细胞、纤维素和神经胶质等通常被染成桃红色或红色，细胞核通常呈黑蓝色。3.结果3.1宏观改变空白组的小鼠活泼依旧，皮毛光泽柔顺，体重呈上升趋势，模型组的小鼠萎靡不振，皮毛没有光泽并杂乱，眼神暗淡无光，并可看出体重明显下降，而治疗组介于模型组空白组之间，不振等病理现象有所改善。空白组呈红色，有光泽，富有弹性。模型组颜色暗淡没有光泽，表面不平，有白色斑点，弹性不足。治疗组稍有弹性，体积基本没变。3.2HE染色结果:3.3MASSON染色结果4.讨论随着社会的发展。肺部疾病的终末期的改变会造成肺纤维化的疾病发生。对于它的治疗，有研究表明，黄芪对肺纤维化的治疗发挥作用[8]。在实验中为使操作简单、方便，保证小鼠的死亡率低，选用鼻腔滴入BLM诱导肺纤维化来造模型；而选用BLM是因为它无毒性，同时BLM

导致肺纤维化作为肺纤维化的经典模型被广泛使用。小鼠肺纤维化模型的病理学变化大致分为三种：第一步是炎症反应、第二部发展为间质细胞增生，最后通常发病为肺的弥漫性纤维化。在我们的实验中也遇到了一些问题，比如说用博来霉素鼻腔造模的方法。肺组织后肺组织发并不均匀，在拍照时每张照片可能选取的肺部组织相对不确定。这样就会导致同样的发病情况因为拍照位置不同，而导致的照片分析结果与实际不一致的现象。人类的肺纤维化发病机理是否与博来霉素导致的人类的肺纤维化，有区别有待验证。虽说小鼠与人类基因大致相同但是一个药物能够治疗小鼠的疾病，对于人类的疾病是否有作用，还须进一步研究，不可一概而论。我们的实验也存在的实验结果难以定量这一问题虽然证明只