聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应技术

（polymerasechainreaction,

PCR）基因克隆（感受态细胞制备、转化、质粒提取、酶切鉴定）;Westernblot（蛋白质提取、SDS、转膜、免疫检测）RT-PCR（RNA提取、逆转录、PCR）实验内容实验考试KaryB.Mullis

USA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)methodTheNobelPrizeinChemistry1993PCRPCR的产物数目以指数级方式增长DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3CycleN理论上可达2n个拷贝原料（pg）产物(ug)

体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段PCR基本原理

PCR反应体系

PCR结果分析

PCR方法拓展

PCR的应用PCR的基本原理

其原理类似于DNA的体内复制，在试管中的DNA的体外合成。5’3’5’3’DirectionofunwindingContinuousreplicationPrimer5’3’Primer5’3’Discontinuousreplication5’3’Primer岡崎片段(okazakifragment)replicationforkDNA的体内复制：原料：templateDNA（genomicDNA

），RNAprimer，dNTPs酶：解旋酶，引物酶，

DNA聚合酶，连接酶反应条件：胞液环境，37℃

反应过程：起始（模板DNA解链、形成引发体）、延长、终止（三阶段）产物：模板DNA（基因组DNA）拷贝数增加一倍PCR：templateDNA（genomicDNA,cDNA）,apairofspecificoligonucleotideprimer,dNTPsDNApolymerasebuffer,三种变化的温度（94,50-70,72℃）,cycles（25-35）denaturation,annealing,extension（三阶段，多循环）目的DNA（特异性）拷贝数增加2n倍Denaturation（变性）templateDNA(dsDNA)——95℃±——denaturation——ssDNAAnnealing（退火）Primer（引物）：两条寡核苷酸链；分别与待扩增的目标片段两端的序列互补。

primersExtension（延伸）

新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。

Taq酶dNTPSDNA聚合酶：催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物5'→3'方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。变性-退火-延伸——一个PCR循环尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。在正常的反应条件下，30次循环，酶的催化反应趋于饱和平台效应

(Plateau)“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。理论上，n个循环后，产量为2n拷贝。实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n，

X为扩增效率，平均为75%PCR反应体系与反应条件

成分加量（ul）灭菌双蒸水X10×PCR缓冲液5.0MgCl22-8.0dNTPs1-2.0引物A1-2.0引物B1-2.0Taq酶0.25模板template血液陈旧血痕组织块或石蜡包埋组织绒毛毛发羊水脱落细胞尿咽拭子DNARNA

mRNAcDNAprimer引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

2.保证引物中G-C比例为50%±15%，ATGC最好随机分布。避免两条引物间或引物内部互补，特别是3’端的互补。4.length<20bpTa（退火温度）=(4×G/C+2×A/T–5°C);

length>20bp

Ta=62.3°C+0.41°C*(%GC)-5°C

保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75°C

范围内。

5.检测目的DNA序列看是否有错配区域，计算机程序分析可以帮助避免使用设计不合理的引物对。引物的3端:必须严格互补。引物的5端:可以不严格互补，可以加酶切位点，加标记物，引入突变位点等。DNA

polymerase催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

(dNTPs)

dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的总称，是靶DNA序列扩增的原料。dNTP浓度根据靶序列的长度和组成而定，一般使用浓度在50-200umol/L之间。buffer/Mg2+

常用的缓冲液体系为10-50mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8,20℃)。TaqDNA聚合酶需要游离Mg2+。PCR反应条件变性95℃5min变性95℃1min退火55℃1min延伸72℃1min延伸72℃1min35cycles变性95℃延伸72℃退火Tm-5℃AnalysisofPCRproductsGelanalysis（琼脂糖凝胶电泳/聚丙烯酰胺凝胶电泳）:PCR产物电泳，EB（溴乙锭）染色，紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。Restriction-endonucleasedigestionanalysis：酶切、电泳分离。产物的鉴定，基因分型，研究变异性。Hybridization：

(Southernblot/dotblot)electrophoresis/hybridizationSequenceanalysis：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。DNA测序

1.Sanger法（双脱氧末端终止法）用4种2´,3´―双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进DNA合成反应，从而获得在不同部位终止反应的大小不同的DNA链，经高分辨率变性聚丙烯凝胶电泳分离，就可以对DNA序列进行分析。Sanger法测定DNA序列2.DNA自动化测序方法要点●基于Sanger法的基本原理●用标记荧光染料的ddNTP●经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离●用荧光检测仪检测信号经计算机分析●得到DNA分子序列DNA自动测序结果举例PCRMETHODSSTANDARDPCRHOTSTARTPCRRTPCRINSITUPCRPCR-ELISAREALTIMEQUANTITATIVEPCR

HOTSTARTPCRIn‘hot-start’PCR,atleastonereactioncomponent,whichcanincludethepolymerase,salt(KClorMgCl2)ordNTP(s),iswithheldfromthereactionuntilthesystemreachesaparticulartemperature.RT-PCR

(Reversetranscription-PCR)1.RNApreparation2.Reversetranscription3.PCR4.ResultAnalysis:QuantificationorcDNAcloneSemi-QuantifyRT-PCR1.RNApreparation2.Reversetranscription3.PCR:a.TargetGeneSpecifiedprimerb.GAPDHorβ-actionprimer4.QuantificationTargetGeneGAPDHorβ-actin在相对定量检测中，为了比较不同样本mRNA表达量水平，要求不同的样本之间起始细胞数目相同，RNA提取效率相同，且目的基因的扩增效率相同，——不可能同时满足。为了避免不同标本在RNA的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别，获得目标基因特异性表达的真正差异——选择一定的内参基因进行校正和标准化。甘油醛-3-磷酸脱氢酶根据实验，选择内参基因REALTIMEQUANTITATIVEPCR

原理：根据荧光染料形成特异性荧光信号的强度，计算出模板

DNA或mRNA的含量用途：

定量分析mRNA或DNA优点：可进行自动化定量分析、降低假阳性实时PCR的基本过程基因克隆医学检测(基因诊断)WHATCANPCRDOFORUS?一、基因克隆:PCR应用PCRProductdigestmixDNAligaseplasmid

Genecloning:

PCRproduct+vector

PCR法设计引物分段PCR基因改造再次PCR获得突变基因(一)基因突变的检测

1、基因缺失或插入

基因检测2、点突变位于酶切位点上的点突变：限制性酶切片段分析法不在酶切位点上的点突变：单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)

致病基因上的未知点突变：PCR-SSCP（单核苷酸多态性，SNP）PCR-RFLP

(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)

限制性片段长度多态性1.分析已知突变。2.突变碱基涉及酶切位点的变化。PCR酶切

电泳PCR-RFLP5’CCACGG3’3’GGTGCC5’*5’CCATGG3’3’

GGTACC5’*ResistancetoNcoIDigestionSusceptibletoNcoIDigestionHomozygousMutantHomozygousWild-typeHeterozygoteDirectionofElectrophoresisPCR-RFLP单链构象多态性(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)的原理及特点单链DNA片段复杂的空间折叠构象(主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的)

一个碱基发生改变影响其空间构象,在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离构象上有差异的分子。PCR-SSCPSSCPPCRPCRATCGWildAmplifyregionofinterestedDenaturesamplesinFormamideorHeatATCGMutantDenaturesamplesinFormamideandHeatATCGATCGDNAmoleculesconformatio