分子克隆技术实验指导

分子克隆技术DNA（MolecularCloning分子克隆技术DNA（MolecularCloning）DNA分子按照既定的目的进行实验前准备PCR扩增及酶切，连接所需酶类试心（小于4000rpm）放置冰浴中备用。本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：ThermoScientificArktikPCR仪，水F1，F2F3一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml离心管，玻璃试管，赛默飞公司提供的QSP盒装吸头及15ml离心管等。GenBank查询目的基因序列GenBank查询目的基因序列找到编码区所在位置，β-ActinCDS80-1207，点击复制编码序列，并保存为.seq格式。根据CDS序列设计引物DNAstarMapDrawFileCDS.seq，点okCDSMapAbsentSites，可见游引物的酶切位点为BamHⅠ，下游引物的酶切位点为HindⅢ。PrimerPremier5软件，点击FileNew，DNASequence。在弹出GeneTank窗口中，粘贴入β-Actin的基因全长序列，选择Asis，ok确定.Primer进入PrimerPremier窗口，点击SearchSearchCriteria窗口PCRPrimer，searchtypePairs。还可以设定搜索区域及产物长度。由于CDS的位置是80-1027，上游引物搜素区域为1-80bp；下游则为1027-1885bp；产物长度为900-1300bp；引物长度一般为18-30bp，无需修改。在SearchParameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，设置完毕后，点击ok开始搜索引物。SearchProgressokSearchResult窗口，搜选择评分最高的引物，简单查看一下引物情况，避免出现一下情况：33GGG应该在55～70度之间，上游引物和下游引物 值最好不要相差太多，大概在％应该在选中上游引物，点击 Primer。在引物编辑窗口的编辑栏中，5’端添加BamHⅠ的序列（GGATCC）BamHⅠ的序列（GGATCC）,点击Analysis.根据结果添加合适的保护碱基再次分析后，点击Primer。如符合条件，点OK，将编辑好的引物输送到同样的方法设置下游引物，在编辑栏中5’端添加入HindⅢ的序列OK，接受引物。RT-PCR获取目的基因0.2μl10mMdNTP、上下游引物各0.3μl、0.3μlTaq酶，经过反转录获得的cDNA模板2μl，最后加RNA酶纯水调整至20μl。72°C2min,2812°C保温。PCRrun按钮，选择设定好的程序，按START开始运行。琼脂糖凝胶电制备1%琼脂糖凝形瓶中加入0.3g的琼脂糖和30ml的TAE缓冲液TAE缓TAE缓冲液。假如适量的6LoadingBuffer，混匀后即可上样。胶回收及DNA的纯化水浴中温浴，每2-3min摇动混合物至凝胶完全融化，1min，12000rpm2min，弃收集管中的滤液，将离心柱套回收集管内。WB至离心柱中。12000rpm2minBufferWB在使用之前必须1.5ml30μlElutionBuffer到柱基质上，室温放置1min12000rpm1minDNA。酶切目的基因和载体,在扩增产物组标记T，载体在扩增产物组标记T，载体组CPCR管中加入如下成分：2μl10x酶切缓冲液，6μl的蒸馏水，BamHHind1μl。TPCR扩增产物10μl，C组加入10μlpET-28α载体10μl。混匀后，用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底，37°C酶切3-4h，酶切结束后，65°C保温5-10min以终止酶切及防止DNA末端退火，取出后置冰浴骤冷，酶切产物可直接进行连接反应。目的基因和载体连接反应TPR4μlA15μlET28a载体，1μl10xT4bufr，0.μlT4A10μl。在阴性对照组CPR.μlpT28α1l0xT4fr.μlT4A10μl。对于有效的连接体系来说合适的载体和目的基因分子数比值控制在一定范围内是有必要的，这个比值为1：31：10，较大的片段可适当提高比值。连接时，PR产物浓度可以尽可能的大，轻混反应物，并在161216h4℃连接过夜。转化及筛选转化前，需进行大肠杆菌感受态细胞的制备10μlDH5α2mlLB液体培养基的试管中，37℃每分钟180-200rpm振荡培养过夜。以1%的接种量将甘油菌种20μl接种到2mlLB培养基中，37OD6000.3～0.43h。在超净工作台里用枪头小心移去上将菌体重新悬浮于400μl预冷的20min大肠杆菌的转化（热激法移液器轻轻吸打使连接产物质粒与感受态细胞充分混合，冰浴30min90s，将管转移到冰浴中将管放入预加温42℃的水浴中1ml无抗生素的LB液体培养基，37°C1ml无抗生素的LB液体培养基，37°C0.5-1h；37℃培养，12-16h后可出现菌落。次日，取出平板观察，挑取阳性克隆进行菌落PCR。快速鉴定阳性重组子PCR2μl10×PCRBuffer，1μldNTPmix，2μl上游引物，2μl总体系进行分装，只需在体积数乘上样品数加1的总体系。LBEP2-3次，然后将同一枪头浸入装有PCRmixture的PCR管中反复吹打以作扩增培养细菌用；另取一PCR管，不加转化子模板，作为阴性对照。初步鉴定阳性重组子，一定致，只需调用相应的程序，按Start运行即可。5μlPCR反应产物，1%琼脂糖电泳分析。紫外检测仪下观察，阳性重组子能得到相应片段的PCR产物。质粒提取及鉴将上清移至另一新离心管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇，混匀，打碎或吸走。12000rpm离心5min，小心用弃去上清，注意不要将沉淀倒走20μlRNaseADNA实验结果与分析：PR-PCR1200bp疑问与解答DoctorA，实验做完了，结果也比较理想，但是有几个问题需要请教一下。在PCR扩增过程中，退火时，为什么引物与模板杂交，而模板之间不复性？MissQ你这个问题问得很好，很多人都不明白这个问题，之所以模板质检DNADNA这是个很常见的问题，很多学生在做实验时都会碰到。若PCRPCR这是个很常见的问题，很多学生在做