地高辛探针制作

DIG（地高辛）杂交一：药品配方（SDW：灭菌后的超纯水）1.1调节pH值用溶液1NNaOH40mlNaOH1.6g5NNaOH40mlNaOH8g5NHCl40mlHCl6.18g1.21Mtris-HClMW:121.14100mltris12.114g用HCl调pH7.5大约用3.75ml（需高温高压灭菌）20XSSC1000mlNaCl 175.32g柠檬酸钠 88.23g用SDW补充到1000ml，用1N的HCl调节pH7.0约需750ul（需高温高压灭菌）30XSSC500ml4.5MNaCl 131.48g0.45M柠檬酸钠 66.17g用SDW补充到500ml，用1N的HCl调节pH7.0约需200ul（需高温高压灭菌）bufferI（Maleicacidbuffer）1000ml0.1MMaleicacid 11.607g0.15MNaCl 8.776g用5N的NaOH调pH7.5（需高温高压灭菌）bufferH（2%Blockingbuffer）50ml（现配现用）10ml10%的Blockingsolution+40mlbufferIBufferIII 500ml 1000ml0.1MTris-HClTris 6.057 12.110.1NaCl 2.922 5.844用1N的HCl调pH9.5约需0.55ml（需高温高压灭菌）10%Blockingsolution:100ml4°C低温保存10gBlocking+100mlbufferI（溶解方法：在微波炉中加热溶解，但不要沸腾，完全溶解后高温高压灭菌）10%SDS200ml20gSDS+200mlSDW过滤灭菌2.0Northernstrippingsolution40ml现配现用（目的是去掉EB和电泳染料）40ml 30ml5%SDS100%formamide2ml（10%SDS）1.5mldeionized（去离子甲酰胺）20ml15ml1MTris-HCl（pH7.5）2ml1.5mlSDW16ml12ml每个杂交管用40ml80C水浴加热。溶解约10min2.1预杂交液（只要澄清可以反复使用） 200ml药品最终浓度与组分 体积 母液50%去离子甲酰胺100ml100%去离子甲酰胺5XSSC33ml30XSSC2%BlockingRegant40ml10%Blockingsolution50mMNaHPO2 410ml1MNaH2PO4pH7.00.1%2ml10%N-LauroylsarcosineN-LauroylsarcosineSDW1mlN-LauroylsarcosineSodiumSalt十二烷基肌胺酸钠.不用灭菌加完试剂后，于60^保温，到无悬浮，无沉淀。-20°C保存。用前1H放置与室温，然后65r保温备用。用完后，室温冷却后放置与-20C保存。1MNaH『O4缓冲液 100ml15.6gNaH2PO4+100mlSDW水中，用5NNaOH调节pH7.0约需12ml.过滤灭菌。10%十二烷基肌胺酸钠10g十二烷基肌胺酸钠+100mlSDW水中，过滤灭菌。地高辛探针DNA制作:10ul质粒DNA+14ulSDW+16ul2NNaOH(Total40ul),室温5〜10min.加4ulSDW,8ul3MNaAC(Ph5.2),120ul无水乙醇，-80°C放置30〜60min(也可以放更长的时间)，4C,13000rpm/20min.(15000rpm/10min)沉淀几乎看不见。去除上清后加入500ul70%乙醇，上下轻摇(此步可-20C下放置过夜)，13000/20min(15000rpm/10min),去上清后彻底干燥。4，加20ulSDW溶解DNA。保存于-20C冰箱即可。特异引物PCR。将PCR产物全量吸入1.5ml管中(可能＞20ul)，做好标记，沸水浴10min后冰浴。准备干净的50ml离心管，做好标记，加入25ml(1/1000)的预杂交液，然后将经过沸水处理过的探针PCR产物加入，摇匀后于65C保温几分钟，冷却到常温后保存于-20C冰箱。特别小心！！昂贵并且可以反复使用。杂交步骤:第一天：Northernstripingsolution目的是去掉杂交膜上的EB和染色物质。于80°C水浴加热。把经过紫外交联的两块膜放入同一个杂交管中（注意膜不要重叠），每一个杂交管放40mlNorthernstripingsolutiono于杂交炉中80C摇晃1h,杂交炉转速最大。时间到后倒掉液体，再加入Northernstripingsolution40ml继续摇晃1h..此时可以吧预杂交液从-20C冰箱中拿出，室温放置全解冻，然后放于65C水浴锅中保温备用。倒掉洗液后，加入2XSSC（用20XSSC配，每个杂交瓶100ml,目的是洗掉甲酰胺）于45C在杂交炉中摇晃，10min钟一次，共两次。4，预杂交，每个杂交瓶中加入20ml预杂交液（65C预热）于45C预杂交3.5h。杂交后将预杂交液倒回回收瓶中（可以反复使用，室温冷却后-20C保存），加入制作好的探针20ml每瓶（事先把探针拿出解冻，解冻后60C水浴）。于45C在杂交炉中杂交16h（时间一般控制在16〜28h之间。但是不能超过28h）.杂交温度一般可以根据两次探针PCR温度确定，但是低的温度对表达强烈的基因和表达弱的基因均有利。准备洗探针的缓冲溶液（Wash-Prodesolution）过夜放置。37CA:2XSSC+0.1%SDS（60ml20XSSC+SDW+6ml10%SDS=600ml）62CB:0.1%XSSC+0.1%SDS（3ml20XSSC+SDW+6ml10%SDS=600ml）一个杂交管只需要A.B液体300ml,洗每次用100ml每管。最后一次用剩下的液体冲洗下即可。第二天：上午杂交液倒回回收瓶，室温冷却后放-20C保存。加100mlA液于杂交管中，37C于杂交炉中最大转速洗涤10min，重复一次。目的是洗掉未结合的探针。〜用剩余A液冲洗杂交瓶后，加入100mlB液，62C于杂交炉中最大转速洗涤30min,重复一次。目的是洗掉背景。配bufferII（阻断剂用bufferIB经配好）.每一个杂交管需要bufferH25ml.Buffer11:2%blocking（5ml10%Blockingsolution+20mlbuffer1）共25ml,倒掉洗液，用bufferI冲洗膜两次，然后加入100mlbufferI平衡膜2〜3min,将膜平衡后，加入25ml每管bufferII,于杂交炉中，37°C,100rpm，摇2〜2.5h.第二天下午：1，配1：20000dilute（抗原抗体结合）25mlbufferI+1.25ul抗体Anti-Dig充分混匀。倒掉bufferII,加入已经配好的抗体抗原25ml于杂交管中，37C于杂交炉中最大转速洗涤30min。2，倒掉bufferI抗体抗原液体，加100mlbufferI于饭盒中，用镊子把膜夹出来放到饭盒液体中（膜正面相背，饭盒用前需要灭菌），再加300ulTween-20（0.3%）活化剂室温于脱色摇床150rpm30min/次，重复一次。目的是洗掉未结合的抗体抗原。同时准备杂交袋，一个大的杂交袋可以剪成4个小的杂交袋。（每膜需要两个袋）。准备BufferIII:CDP-Star=100:1,即：600ulbufferlll+6ulCDP-Star,每膜需要600ul.3,倒掉洗液，马上加入少许bufferIII,平衡几分钟后，用镊子夹膜于拆好的杂交袋中正面朝上，把膜放置于干净的滤纸上，从点样孔处加入配好的CDP-Star,上下开合杂交袋10下左右，并用于指轻轻涂抹膜，让CDP-Star于膜充分