骨髓间充质干细胞肌肉注射移植诱导大鼠糖尿病下肢缺血

骨髓间充质干细胞肌肉注射移植诱导大鼠糖尿病下肢缺血

1骨髓细胞处理和转归示踪设计：自身的动物比较试验。时间及地点:于2009-09/2011-02在遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室完成。材料:实验动物:清洁级SD大鼠共50只,其中两三周龄20只,雌雄不拘,用于BMSCs的制备,另外30只成年雄性SD大鼠,体质量180~250g,用于糖尿病后肢缺血模型制备。全部动物均购自解放军第三军医大学大坪医院动物实验中心,许可证号:SCXK(渝)2007-0005,并在专用动物室清洁环境下饲养。实验所采用的动物实验操作程序经遵义医学院实验动物伦理委员会审议批准。主要试剂与仪器:方法:大鼠BMSCs的分离、培养:颈椎脱臼法处死两三周龄SD大鼠20只,无菌条件下取下两侧完整股骨,浸入体积分数0.1%新吉尔灭15min,剥离股骨附着肌肉,用含双抗的D-PBS反复清洗;剪开股骨两端,用D-PBS冲洗骨髓腔,收集含骨髓细胞的洗脱液,1000g离心5min,弃上清,细胞沉淀用含终浓度为10μg/LbFGF、体积分数10%FBS的LG-DMEM培养基再悬浮,每只大鼠分离的骨髓细胞接种两个T25培养瓶,置37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱培养。每2d换液1次,同时洗脱未贴壁的血细胞,当BMSCs生长汇合度达60%~70%时,采用胰蛋白酶消化法,按2×108L-1细胞浓度进行传代培养。模型BMSCs移植:采用模型大鼠自身对照,注射量参考文献的方法进行:BMSCs移植操作如下:取2×106个第3代BrdU标记BMSCs,用250μL生理盐水制成单细胞悬液,自左侧股动脉离断处起分10个点将干细胞悬液注射入左后肢股直肌和腓肠肌中;右后肢相应部位注射等量生理盐水作为对照。数字减影血管造影(DSA):随机选取糖尿病模型大鼠及移植BMSCs后2,6周模型大鼠,经10%水合氯醛腹腔麻醉后沿腹正中线偏右纵行切开腹壁全层,显露腹主动脉,动脉夹夹闭近心端,于动脉夹和腹主动脉分叉之间顺行穿刺插管,采用30%碘海醇,以1mL/s速度、111kPa压力注入4mL对比剂,进行双后肢DSA检测。毛细血管密度变化分析:取移植后2周模型大鼠双侧股直肌和腓肠肌,40g/L多聚甲醛固定24h,横切股直肌和腓肠肌为2~5mm厚的组织块,进行常规石蜡包埋,切片(厚5μm),经苏木精-伊红染色后置光镜下观察,随机选取400倍下10个视野,分别统计股直肌和腓肠肌的毛细血管数和肌纤维数,以两者比值计算毛细血管密度。BrdU标记BMSCs的体内示踪:取材及石蜡包埋、切片同上步骤所述。采用小鼠来源BrdU一抗结合辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体免疫组织化学法,经DAB显色、苏木精复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明和中性树脂封固后,置光镜下观察BrdU标记BMSCs移植细胞的体内存活与组织整合情况。主要观察指标:BMSCs生长情况及BrdU体外标记率;BMSCs移植糖尿病后肢缺血模型的血流重建;移植细胞的体内转归示踪与血管新生。统计学分析:由第一作者用SPSS13.0软件包进行统计学分析,实验数据以_x±s表示,采用t检验。P<0.05表示差异有显著性意义。2结果2.1bmscs移植结果30只模型大鼠中3只于STZ注射后死于糖尿病相关并发症;BMSCs移植共计27只,其中3只于BMSCs移植后死亡,原因与动物经各种干预处理后体质状况下降,并发厌食、腹胀或感染所致,共24只纳入结果。2.2brdu体外标记bmscs的细胞原代培养第3天细胞集落生长汇合度可达50%~60%,细胞以梭形为主,排列较杂乱,见图1a。传代培养12h后细胞全部贴壁,48h后细胞基本为梭形,并呈漩涡状排列,见图1b。BrdU体外标记的BMSCs阳性细胞其细胞核呈棕褐色,而未被标记的细胞经苏木素复染后细胞核呈蓝色,见图2。随机选取10个视野(×200),分别计数阳性细胞数和阴性细胞数,根据阳性细胞数占总细胞数的比值计算的BrdU标记率为(82±3)%。2.3大鼠bmscs的表型特征流式细胞仪表型鉴定的结果显示,分离纯化的大鼠BMSCs具有典型的间充质干细胞表型特征,高表达CD90和CD29,不表达CD45,见图3。2.4糖尿病制模检测STZ注射前及注射1,7,14d的大鼠外周血血糖值分别为(5.4±0.5),(27.3±1.6),(27.3±2.2),(25.4±2.3)mmol/L,注射STZ后的血糖检测值均高于16.7mmol/L的糖尿病制模标准。糖尿病模型大鼠双后肢结扎剥离股动脉及其分支后,后肢骨骼肌急性缺血并呈暗紫色,肢体冰冷。2.6移植细胞2周后双术后血管观察结果DSA结果显示,未结扎股动脉的糖尿病大鼠双后肢股动脉主干连续,分支清晰,侧支循环较少,见图5a;糖尿病后肢缺血模型大鼠双后肢股动脉主干于腹股沟韧带处中断,股动脉分支未见显影;移植2周后双后肢可见血管显影,左侧后肢较右侧后肢血管稍丰富,见图5b;移植6周后双后肢血管更为丰富,左侧高于右侧,见图5c。苏木精-伊红染色组织切片毛细血管密度分析显示,移植细胞2周后左侧后肢股直肌毛细血管密度为0.296±0.10,高于右侧后肢股直肌的密度(0.132±0.06,P<0.05);左侧后肢腓肠肌的毛细血管密度为0.357±0.15,也高于右侧后肢腓肠肌的密度(0.225±0.08,P<0.05)。3细胞移植对bmscs的分离与体外培养的意义糖尿病属全身性疾病,常累及心脑血管、肝、肾、神经等重要组织器官,并引发各种严重并发症。在糖尿病基础上并发下肢神经和程度不同的血管病变致末梢供血不足,可以是二者之一或是兼而有之。在无有效控制干预措施下,糖尿病足可因难以治愈的下肢溃疡、感染甚至坏疽,而最终只能通过截肢来挽救生命,成为非创伤性截肢的首要原因,也是临床上必须面对的常见治疗难题。近年来,以干细胞为代表再生医学研究已成为糖尿病足治疗研究新的关注点。骨髓干细胞是目前再生医学研究领域最常选用的种子细胞来源,这与其富含多种具有多潜能性的成体干细胞有关。Hamano等采用结扎左侧股动脉及其分支的方式建立大鼠后肢局部缺血模型,用去除红细胞后的骨髓细胞分7个点注射入缺血的肌肉中,移植骨髓细胞后可诱导左后肢血管新生,血流量增加。谷涌泉等分别采用小腿局部注射自体BMSCs移植,患者总的疼痛缓解改善率分别为76.5%,随访1年的保肢率为83.3%。这些研究提示,骨髓来源干细胞有望成为治疗糖尿病足的种子细胞来源。深入研究移植细胞的存活、组织再生修复等体内转归与机制,对评价骨髓源干细胞治疗糖尿病足的应用价值等具有重要意义。本实验所用的BMSCs是存在于骨髓中的成体干细胞类型之一,尽管数目不低,但也仅占骨髓有核细胞的1/106~1/105。为满足细胞移植所需的细胞数的要求,通常需要对其进行分离纯化和体外扩增培养,以满足治疗研究的实验需求,这也是目前普遍开展干细胞体外培养扩增研究的意义所在。直接对分离的骨髓细胞采用贴壁培养,以筛选纯化BMSCs具有操作简便,成本低,适合各种组织损伤性疾病BMSCs移植治疗的研究。本实验采用贴此法在原代培养48h换液去除未贴壁的血细胞,保留的贴壁细胞增值形成大小不等的细胞集落,培养约1周时可进行传代培养。对传代培养的细胞表型分析结果表明,其高表达CD29和CD90,不表达CD45,具备间充质干细胞的表型特征,说明本实验所分离、培养获得的细胞为高纯度的BMSCs。研究还表明,骨髓间充质干细胞其数量和增值分化能力随供者年龄增大而逐渐降低。鉴于此点考虑,本实验选用二三周龄SD大鼠作为BMSCs来源,经体外培养发现其集落形成能力旺盛,增值能力强,采自同一大鼠的BMSCs培养至第3代所获用于移植的BMSCs总数在(4.0~5.0)×106个,可满足2只模型大鼠左后肢的移植用量。移植BMSCs后的模型大鼠DSA血管造影显示股动脉主干未见再通,但其周围及其远端出现丰富的“新”血管分布,并随移植时间的推移越发明显,移植BMSCs的左后肢血管多于右侧后肢。由于DSA血管显影技术不能就血管密度等进行定量分析,故仅凭DSA结果尚不能判定后肢血管这一特征性变化是干细胞移植后的血管新生还是自发再生抑或侧支开放所致。值得关注的是,本实验采用免疫组织化学染色观察到模型大鼠移植2周后的BrdU标记BMSCs参与了微动脉壁的构成,且同一时间点组织切片左侧股直肌和腓肠肌的毛细血管密度值均高于右侧相应部位,这一结果证实了移植的BMSCs参与了后肢缺血的血管重建。综上所述,本实验通过贴壁培养筛选法得到高纯度、高活力的BMSCs。通过下肢肌肉多点注射移植糖尿病大鼠后肢缺血模型,初步证实了移植BMSCs参与了缺血组织血管重建的实验证据。在深入阐明BMSCs移植治疗糖尿病足的作用于机制前,还需对移植细胞数、移植部位与途径等进行探索,同时,还需就移植BMSCs后缺血组织局部细胞因子表达变化等可能与移植细胞修复糖尿病足损伤有关的因素进行深入研究,以便为临床采用BMSCs移植治疗糖尿病足等下肢缺血性疾病的研究与应用提供更为完整的理论依据。0糖尿病大鼠下肢率bmscs的移植治疗自Tateishi-Yuyama等首次报道采用自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血患者以来,骨髓来源干细胞移植治疗缺血性疾病成为新的研究关注点。尽管骨髓源干细胞移植能改善糖尿病足下肢缺血性疾病的症状与体征,但目前仍不清楚是骨髓中哪类干细胞起主要作用,更缺乏移植细胞的体内存活、分化及参与血管再生的实验依据可循。骨髓含有造血干细胞、内皮祖细胞和间充质干细胞等多种成体干细胞成分。研究表明,适宜条件下骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs)具有分化为几乎所有三胚层类型细胞的能力。已有研究证实BMSCs可向内皮细胞分化,并可促进肿瘤血管形成。这些研究提示,BMSCs有望成为治疗包括糖尿病足的在内的下肢缺血性疾病种子细胞的新来源。故本实验选择具有多向分化能力的BMSCs,对糖尿病大鼠后肢缺血模型进行肌肉注射移植治疗,通过BrdU标记BMSCs体内示踪、数字减影血管造影结合毛细血管密度分析,以便对移植BMSCs的体内存活、血管再生修复能力等进行科学评价,为今后BMSCs移植治疗糖尿病足等缺血性疾病的研究和临床应用提供新的有价值的实验依据。大鼠BMSCs表型分析及BrdU体外标记:取第3代BMSCs,进行CD45、CD29和CD90表型分子的流式细胞仪检测。同时,按1×107L-1细胞浓度接种于预置盖玻片的24孔培养板中,置37℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养6h,避光加入终浓度为10μmol/L的BrdU继续培养48h,取出盖玻片,采用小鼠来源BrdU一抗结合辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗免疫细胞化学法,经DAB显色后随机选取200倍镜下10个视野,计算BrdU标记细胞比率。大鼠糖尿病后肢缺血模型制备:雄性SD大鼠30只,经普食适应性喂养1周后,按55mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病模型。于注射后1,7,14d剪尾取血测血糖浓度,以血糖值>16.7mmol/L作为糖尿病制模成功标准;糖尿病大鼠经10%水合氯醛(0.35g