我国主要蚊媒研究概况

我国主要蚊媒研究概况

蚊子不仅吸收和传播严重的血液疾病。在我国,蚊可传播疟疾,丝虫病(斑氏丝虫病和马来丝虫病),流行性脑炎(ep-idemicencephalitisB)和登革热/登革出血热(DF/DHF)。在国外,蚊还可传播黄热病(yellowfever)、西尼罗河热(westmilefever)、基孔肯雅热(chikunguanyafever)、东方马脑炎(easternequineencephalomyelitis,EEE)西方马脑炎(westernequineen-cephalogelitisWEE)等多种病毒病和帝纹丝虫病及恶丝虫病。蚊媒介研究是流行病学和防治的首要工作之一。现就我国主要蚊媒研究概况综述如下。1中华按蚊an.mewell疟疾是由4种人体疟原虫所引起的世界性蚊媒传染病。在我国,疟疾也是长期危害人民健康的严重疾病之一。目前全球仍有100多个国家约22亿人受疟疾威胁,每年临床病例3~5亿。死亡人数约270万。疟疾媒介较早受到寄生虫学和医学昆虫学工作的重视。例如1937年,已故冯兰州教授把下列7种按蚊作为我国的重要媒介:五斑按蚊(Anophelesmaculipennis,Meign,1818);萨氏按蚊(An.saeharovi,Favre,1903);中华按蚊(An.sinensis,Wiedemamm,1928);库态按蚊(An.Culicifa-cies,Giles,1910);杰普尔按蚊(An.Jeyporiensis,James,1902);微小按蚊(An.Minimus,Theobald,1901);帕氏按蚊(An.Pat-toni,Christophers,1926)。通过近半个世纪大量自然腺感染率和流行病学调查,结合按蚊生物系统学和嗜血性等重要生态习性的研究,已澄清了重要媒介的种类,并对它们的媒介关系有了深入的了解,在很大程度上改变了以前的认识［１］。在上述7种按蚊中,现知除中华按蚊、微小按蚊和杰普尔按蚊外,与我国疟疾的传播无关或关系不大。值得一提的是,五斑按蚊是米赛按蚊(An.Messeae,Falleroni,1926)鉴定之误,它可能是北疆疟疾的媒介。另外,有些国外文献仍把帕氏按蚊称作华北的重要媒介［１］。我国疟疾的重要媒介实为下列4种。1.1嗜人按蚊(An.anthropophagus,Xu&Feng,1975)该蚊是我国独有蚊种,分布在北纬34(以南地区,是其分布区域疟疾和马来丝虫病的重要媒介。嗜人按蚊是中华按蚊复合组种类。两者幼虫、蛹和成蚊的形态非常近似,过去一直被认作是中华按蚊,直到20世纪50年代末才根据卵的形态的比较、杂交、DNA限制酶切长度、DNA探针以及rDNA转录间隔2区(rDNAITS2)序列研究,确认为中华按蚊不同的一蚊种［１］。嗜人按蚊与中华按蚊的生态习性和对恶性疟原虫的易感性明显不同。雌蚊偏吸人血和内栖,对间日疟原虫和恶性疟原虫高度或比较易感。因此,它是一个高效的疟疾最重要的传播媒介。嗜人按蚊的防制主要采取DDT室内滞留喷洒或拟除虫菊酯处理蚊帐,可以明显降低室内外成蚊密度和疟疾发病率［１］。1.2中华按蚊该蚊广布除新疆和青海以外的全国各省区,由于雌蚊人蓄血液兼吸,并以刺吸家畜血液的居多,对恶性疟原虫仅低度易感,其传播作用远逊于嗜人按蚊。它是广大平原,特别是水稻种植区疟疾和马来丝虫病的重要媒介。这种按蚊虽然不是高效的传播者,但由于种群数量大,是以维持疟疾的低度流行,甚而在适合条件下,引起暴发性流行［１］。中华按蚊和嗜人按蚊经常存在于同一区域,因而采取上述防制措施,实际往往兼及两种媒介。但是由于中华按蚊半内栖,这些措施的防制效果不如对嗜人按蚊。两种成蚊、蛹和幼虫形态非常近似,长期被视为同一蚊种,我国学者20世纪70年代中期,根据卵甲板的宽窄,给予区分［１］。近年来,嗜人按蚊与中华按蚊DNA限制性片段的长度有明显差异,并建立了DNA探针区分两蚊,根据核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)序列分析比较中华按蚊的差异为28.8%,更进一步证明嗜人按蚊为一个独立种［１～３］。马雅军等［２］用随机扩增多态性DNA技术研究我国9省10个代表点的中华按蚊自然群体的遗传多态现象,根据23个等位基因位点进行分析,结果显示中华按蚊群体的遗传结构基本相同。1.3大劣按蚊大劣按蚊是一个包括A、B、C、D、E型以及林栖按蚊(An.nemophilous,PeytonetRamalingam,1988)和高砂按蚊(An.takasagoensis,Morishita,1946)的复合体,我国对大劣按蚊的分类地位和传疟作用已有综合介绍。通过核型、卵的电镜扫描以及rDNA-ITS2片段PCR扩增,已知我国大劣按蚊存在有A和D两型［４］。海南岛的大劣按蚊属A,是该岛丛林山麓疟疾的主要媒介,有很高的媒介效能;云南省的是D型,也有疟原虫自然腺感染雌蚊发现,表明在当地也起到疟疾传播作用［４］。王冬等［５］应用线粒体DNA细胞色素氧化酶亚单位I(mtDNA-COI)基因序列特征阐明我国大劣按蚊A,D群体的遗传差异和分化水平。结果显示大劣按蚊A的单倍型共3个。大劣接蚊D的单倍型共6个,均匀分布于3个群体。勐腊群体内错配平均数(7.4412)明显大于江城群体(1.2794)和海南群体(1.0513),表明勐腊群体内个体间分化程度最大。分步AMOVA的计算结果显示群体问基因交流有限(Fst=0.7999),群体间变异(79.99%)明显大于群体内变异(20.01%)。揭示我国大劣按蚊A、D群体之间的遗传差异较小,个体间的分化水平较高［５］。1.4微小按蚊它分布北纬32(以南,特别是丘陵坝子等地区的重要媒介。幼虫主要滋生在缓流,如小溪、沟渠、渗出水等。早在20世纪50年代,我国已发现海南岛和大陆的微小按蚊存在嗜血性和栖息上的差异,即海南岛的主吸人血和内栖,而大陆的则不同程度地吸取家畜血液和外栖,这种差别也反映在它们的媒介效能。微小按蚊它归属于按蚊属(GenusAnopheles)塞蚊亚属(Subgenuscellia)迈蚊系(Myzomyiaseries)微小按蚊种团(An.minimusgroup)近缘种包括:乌头按蚊(An.aconitus,Doentz,1912)、溪流按蚊(An.fluviatilis,James,1902)和瓦容按蚊(An.varuna)［１～６］。近年来国内外研究认为微小按蚊为一复合体,但分型情况还未统一,有分为A、B型,或分为A、B、C型,并可能存在其他隐型。微小按蚊近缘种间以及微小按蚊复合体内各成员间成虫和(或)幼虫形态差别比较细微,并且该蚊存在较多个体变异,因而鉴别比较困难。而不同种,型蚊虫其生态习性,分布区域、媒介效能等方面存在差异,正确区分微小按蚊复合体成员及其近缘种,对于研究该蚊及制定有效的防疟措施具有重要流行病学意义［７］。俞渊等［７，８］根据形态特征和行为习性将海南岛该蚊分为A、B型。两型在成虫翅脉斑型,食窦甲形态,幼虫头部颜齿数,嗜血习性,栖息习性和DDT敏感性等方面存在较明显差异。之后的生态学研究表明,随着城镇开发和大规模使用杀虫剂,微小按蚊生态习性也发生变化,并且不同地理群体微小按蚊发生的生态环境,对疟原虫敏感性及种群结构等方面不尽相同。王学忠等［９］比较了云南省5个地理株微小按蚊酯酮同工酶谱的结果,各地理株之间酶谱存在一定差异,其中4个地理株进行随机扩增多态DNA分析,也表明不同地理株存在遗传分化。郑彬等［１０，１１］应用微卫星锚定PCR技术研究研究云南不同地理来源微小按蚊的群体遗传结构,结果显示以多态位点比例衡量各种群的遗传多态性,云南不同地区微小按蚊均共享较高多态性,其中元江(c)的变异程度较低,为43.3%,潞西(A)的变异程度较高,为78.6%。FST和(结果提示,微小按蚊的遗传变异主要存在于种群内部。微小按蚊A与c分别或两者合并分析,Nm均大于1。系统树主要分为两支,元阳(c)、大关(c)和勐腊(c)聚为一支;另一支分为元江(c)与潞西(A),新平(A)和临沧(c),以及勐腊(A)共3层。提示各群体间遗传距离部分与亲缘种分类有关,未发现与地理距离相关。史慧勤等对我国微小按蚊广西、云南、海南6个地理株和越南Caonguen株rDNA-ITS2PCR扩增片段和序列差异作分析,获得基因片段总长为561(563bp,发现地理株间ITS2序列差异程度不同,分析表明元江株为微小按蚊C型;其余6个地理株为A型。应用限制性内切酶Sau96Ⅰ对微小按蚊复合体rDNA-ITS2PCR扩增片段作酶切分型,结果同样显示两型差异［１２］。2淡色库蚊的确定我国马来丝虫病的主要媒介是嗜人按蚊和中华按蚊。这两种按蚊研究的进展已如上述。斑氏丝虫病的主要媒介是淡色库蚊和致倦库蚊。它们以及尖音库蚊指明亚种和最近发现的骚扰库蚊都属尖音库蚊复合体。陆宝麟等［４］建立了4个成员的实验室种群,对它们进行了杂交、单糖、表皮碳氢化合物以及脂肪酸的气相色谱分析,雄蚊阳茎DV/D和幼虫形态数值分析等一系列的研究,阐明了我国尖音库蚊是包括4个亚种的复合体,致倦库蚊并非如国外学者看作的独立物种,淡色库蚊也不是有些学者认为的尖音库蚊和致倦库蚊的“中间型”。淡色库蚊对杀虫剂抗性研究报告很多。王金福等［１３］采用分子杂交技术和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析鉴定多种酯酶等位基因具有明显的选择作用。双硫磷品系为B1型;毒死蜱和敌百虫品系为B2型;马拉硫磷品系为B1型和B1/B2杂合型。不同地区采集的种群表现出不同的酶型频率分布。公茂庆等［１４］对淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因进行了克隆与表达差异的鉴定。结果显示CYP6FI在淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系中表达水平高于敏感品系,且CYP6F1基因在淡色库蚊各个发育阶段有不同的表达。田海生等［１５］发现13个差异表达基因和2个特异表达基因与淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性和敏感性相关。3传播水生动物传播种类型病毒我国登革热的媒介是埃及伊蚊(Aedesaegypti,Linnaeus,1762)和白纹伊蚊(Ae.albopictus,skuse,1894)。白纹伊蚊原是广布亚洲热带、亚热带并伸达温带的蚊种,但从20世纪80年代起,已传到北美、南美、欧洲和非洲的有些国家,引起世界卫生组织和有关国家的重视。在我国,它的分布很广,包括辽宁(北至沈阳)、河北、山西、陕西、山东、河南、江苏、浙江、福建、台湾、广东、香港、澳门、广西、四川、贵州、云南和西藏。但以北纬32(以南为普通。雌蚊偏吸人血,多在户外侵袭人体,但也有在室内叮咬吸血者。雌蚊在饱吸血液之后以及在卵巢发育过程中会再次或多次吸血。白纹伊蚊是“半家蚊”,多滋生在居民点及其周围的各种人工容器中,包括大小能积水的容器物,轮胎以及室内盆景和花瓶积水和植物容器,包括竹筒、树筒、叶液积水以及石穴、水泥地等。白纹伊蚊刺叮凶猛异常,刺叮后皮肤奇痒,可引起皮肤红肿,局部皮炎,甚至全身性皮炎,抓破后易溃疡感染。除刺叮骚扰外,更重要的是多种疾病的传播媒介［３］。1978年和1980年我国广东、海南曾发生过登革热流行。白纹伊蚊是广州佛山、中山和广州等地登革热的重要媒介。有些单位发病率达30%~40%以上,严重危害人民健康。除些之外,实验室感染表明,通过刺叮能传播黄热病、西方马脑炎,委内瑞拉马脑炎,西尼罗河热、基孔肯尼亚热等多种病毒性疾病,是传播病毒性疾病的潜在性媒介［３，１６］。3.1登革病毒在蚊体内的复制、分布及传代登革病毒和其他正链RNA病毒一样,在敏感细胞内进行复制。登革病毒微粒由一个外层糖蛋白和病毒衣壳蛋白包裹基因组构成。衣壳蛋白位于宿主-衍生脂质双层内。病毒进入期间,E蛋白形成糖蛋白鞘与细胞表面受体分子连接,有助于经过网络蛋白介导内吞作用内化病毒,随着内化发生,内涵体小泡酸化,激发病毒由糖蛋白结构再排,驱动病毒和内吞膜融合,释放病毒RNA进入胞质,正链RNA被翻译成为一个多聚蛋白,它被病毒和细胞蛋白酶加工成为三个结构即衣壳蛋白(C)、前膜蛋白(prM)、包膜蛋白(E)和7个非结构蛋白(NS1,NS2A/B,NS3,NS4A/B,NS5)［１７，１８］。近年来,国内外学者用口感染和胸内注射方法来观察登革病毒在蚊体内的繁殖动态,扩散与分布情况。研究表明,两种伊蚊对登革病毒的复制和繁殖总量基本一致,病毒在蚊体内2~3d即可检出,随时间延长,病毒滴度有规律地逐渐增加。繁殖高峰时间为8~11d,病毒可在蚊体内存活30d以上。病毒在宿主细胞内持续感染,可使病毒突变,导致变异株的产生［１９］。陈虹等［１９］在实验中发现病毒突变是由于病毒的表位在该种病毒持续感染的细胞培养中被修饰所致。谢超等［２０］利用蚊虫连续石蜡切片免疫组织化学技术,对登革Ⅱ型病毒(DEN-2)感染白纹伊蚊后的散播时间、程度及组织器官的感染顺序进行监测,结果表明:大剂量感染登革Ⅱ型病毒后,在蚊虫消化道的主要部位以及大多数组织包括神经及内分泌系统在内如诞腺、脑、神经节等亦检测到病毒抗原。登革Ⅱ型病毒一旦感染并逸出中肠会迅速侵染其他组织。从各组织感染率的高低推断,病毒逸出中肠后通过血淋巴传播到其他组织的顺序通常为:前肠、涎腺、咽部神经节、脑及食管下神经节、后肠及复跟的小眼等。蚊媒在虫媒病毒所起的媒介效能,不仅取决于蚊种、数量、生物学特性、与人关系,而且还取决于对该病毒的易感性,传播能力及经卵传递力等。虫媒病毒如何在自然界长期保存也是一项重要而复杂的问题,一直为流行病学工作者所关注。通过大量的现场和实验观察,认识到病毒在蚊虫间的传递对保存病毒有一定的重要性。研究表明,DEN能通过其媒介蚊虫而垂直传递,并在很多现场采集及实验观察下得到证实。赵星等［２１］利用细胞及分子生物学技术,研究白纹伊蚊贵州省贵阳、兴义、毕节株对1-4型登革病毒(DEN1-4)的垂直传递能力。结果显示白纹伊蚊贵阳、兴义、毕节、海南株亲代蚊虫均对DEN易感;白纹伊蚊兴义株与海南株均能垂直传播DEN-1,4到子3代,传递DEN-3到子2代,白纹伊蚊兴义株能垂直传递DEN-1到子2代,DEN-4至3代,未发现能垂直传递DEN-2,3,提示对DEN1-4易感的白纹伊蚊贵阳、兴义、毕节株能垂直传递DEN,且对DEN的垂直传递能力与其地理来源有关,贵州省3个地方株的白纹伊蚊卵可在干燥室温下越冬保存DEN。林立辉等［２２］采用C6/36培养的DEN经口感染白纹伊蚊,不仅对DEN有较高的感染率(32.1%~32.8%),而且通过直接叮咬乳鼠,也能传播DEN。对感染雌蚊的子1和子2代雌雄成蚊分别进行全虫均浆分离和直接叮咬乳鼠法检测,也证明白纹伊蚊能经卵传递DEN,至少可传2代以上。郭晓霞等［２３］也证明登革Ⅱ型病毒能在白纹伊蚊滞育卵内存活并传至子代。3.2我国不同地区白纹伊蚊基因序列特征蔡燕丽等［２４］探索广州市白纹伊蚊线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因(COI)序列的特征,分析同一城市不同环境下白纹伊蚊的遗传变异。用单蚊抽提广州市不同点采集的白纹伊蚊基因组DNA,扩增细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因片段,联合单链构象多态性PCR(PCR-SSCP)技术分析COI基因片段多态性并筛选部分样品进行克隆测序,用软件比对分析序列的差异。结果显示广州市不同采样点白纹伊蚊PCR扩增后获得709bp的COI基因部分序列,序列分析出现12个变异位点,变异率为1.69%。聚类分析显示广州株白纹伊蚊不同采样点的群体间出现部分分化。提示广州市不同采样点的白纹伊蚊线粒体COI基因出现部分遗传多态性,可能与城市化发展下白纹伊蚊孳生环境的变化有一定关系。陈虹等［２５］扩增白纹伊蚊COI基因片段并进行克隆测序;用邻接法进行分子系统发育分析。结果显示各地理株白纹伊蚊COI基因片段序列长度均为415bp,所测各株序列均无缺失。云南思茅株的碱基转换率为1.93%,颠换率为0.24%。贵州麻尾株和广西南宁株的转换率为0.48%。各地理株中思茅株与麻尾株关系较近,麻尾株与南宁株关系较近,其余11个地理株均为同型株。周光智等［２６］用20个随机引物对中国的北京、广州、上海、成都和日本的冲绳、长乐寺等6个不同地理株的12只白纹伊蚊个体基因组DNA进行扩增,通过随机扩增的多态DNA技术来研究不同地理株白纹伊蚊的遗传差异。结果显示,有8个引物显示清晰的扩增带并呈显著多态性。通过条带计算遗传距离发现:同地理株的不同个体之间遗传距离不同,不同地理株的不同个体之间的遗传距离也不同,成都和上海两个地理株之间的遗传距离最小,长乐寺和其他白纹伊蚊地理株之间的遗传距离最大,提示不同地理株之间的遗传差异。3.3白纹伊蚊对登革病毒易感性研究有关白纹伊蚊易感性研究进展已有报告［２７～２９］。现将最近一些发表与未发表最新研究成果补充如下:郑学礼课题组已在登革病毒感染受体筛选鉴定方面取得重要进展,作者采用VOPBA对白纹伊蚊不同发育时期虫体表达DENV的连接蛋白分子进行筛选,从白纹伊蚊幼虫样品筛选出25、35、50ku登革病毒连接分子;蛹样品筛选35、50ku分子;雄蚊样品可见到50ku分子,雌蚊样品亦筛选出35、50ku分子。35ku分子在幼虫、蛹及成蚊雌蚊的三个阶段均具有,而雄蚊的成蚊则完全没有这一分子;最近亦在白纹伊蚊的中肠组织、马氏管、卵巢也发现35ku登革病毒连接分子;作者采用相同蛋白样品量,SDS分析致倦库蚊各阶段组织,病毒覆盖结合试验检测不同发育时期致倦库蚊样品时未检测到35ku分子;二维电泳分析白纹伊蚊C6/36的膜蛋白,病毒覆盖结合试验亦检测出35ku分子,经质谱序列测定,分析35ku蛋白序列与埃及伊蚊阴离子通道蛋白鉴定较高,该分子功能研究正在进行。雄蚊不吸血,只吸植物汁液及花蜜。雌蚊必须吸食人或动物的血液卵巢才能发育、产卵,同时在吸血过程中获得病原体而成为传播媒介,上述结果提示35ku分子可能具有组织特异性和病毒向性,并认为其与病毒的感染相关,在病毒与宿主细胞的相互作用方面,扮演角色［１７］。陈晓光课题组已对白纹伊蚊基因组进行测序并组装分析,尚未公布。同时陈晓光等通过对白纹伊蚊小RNA的深度测序以及生物信息学分析,共测得序列12663936条,1801570种［３３］。其中通过与miRBasel4.0数据库比对分析得到92种已知miRNAs,通过miRNA预测软件mireap预测新的miRNAs46种。共选择12种-miRNAs进行验证,包括6种保守性miRNAs与6种蚊虫特异性miRNAs。所有的miRNAs在白纹伊蚊中均得到验证,并且大多数miRNA在蚊虫的不同发育阶段具有表达差异。共选择4种-miRNAs(miR-184,miR-998,miR-989、miR-N1)做吸血前后的表达差异分析,其中3种miRNAs在雌蚊吸血后表达水平增加,miR-N1在雌蚊吸血后才开始有表达。埃及伊蚊(Aedesagypti)属双翅目(Diptera)蚊科(Culici-dae)伊蚊属(Aedes)覆蚊亚属(Stegomyia)A组。分布于世界热带和亚热带地区,在我国,分布于北纬22(以南的一些地区,包括台湾省南部、海南省、广东省和广西壮族自治区的个别岛屿,为世界大多数地区登革热(Denguefever)和登革出血热(Den-guehemorrhagicfever,DHF)最主要的传播媒介之一,同时还是城市型黄热、基孔肯雅、立谷热等虫媒病的重要媒介［２，３］。1978年在广东佛山石湾发生有登革热流行,接着在海南以及广东、广西的部分地区都先后发生流行或大流行,其中海南以及广西的合浦、防城及广东的少数地区主要由埃及伊蚊传播。在海南岛1980和1986年两次流行中,发病人数达50余万人之多［３０］。埃及伊蚊全基因组已测序组装完成并公布,埃及伊蚊对黄病毒易感性、信号通道、蚊虫抗性及监测方面,国外均取得很大进展,我国在这方面研究仍较为薄弱。4带论蚊病毒的传播JE是我国流行的蚊媒病之一。我国曾有白纹伊蚊和伊川伊蚊是乙脑传播媒介的报告,但王逸民等通过大量流行病学、生态学实验等的系统研究,提出了三带喙库蚊是乙脑病毒的主要传播媒介,目前已获国际公认［１］。三带喙库蚊(Cx.tritaenio-rhynohus,Giles,1901)也是一个复合体。作为一个重要媒介蚊种,也需要作比较系统的研究。淡色库蚊和致倦库蚊也可能起次要传播媒介。乙脑病毒的传播媒介可因地区不同而存在差异。云南乙脑高发区洱源县的麻翅库蚊带毒率高于当地采到的三带喙库蚊,而且蚊虫出现时间及病毒检出时间也早于三带喙库蚊。国内外曾在十余蚊虫及蠓分离到乙脑病毒,提示病毒可由多种蚊虫携带传播。如国外曾从赫坎按蚊分离到病毒。该蚊在我国分布于新疆,而这一地区既无三带喙库蚊的分布,也无乙型脑炎的报告,这些蚊虫在我国成为乙型脑炎病毒的潜在媒介。另外,国内从蠛蠓和库蠓中分离到乙脑病毒。5关于蚊的形态和物种近年来我国在疟疾、登革热(登革出血热媒介的研究有了很大进展,但仍有需进一步研究的问题。5.1蚊媒病媒介种群鉴定蚊在分类上属于昆虫纲,双翅目,蚊科(culicidae),蚊科分为3个亚科,即按蚊亚科、巨蚊亚科和库蚊亚科。全世界的蚊虫已知34属约3300种及亚种,我国已发现15属333种及亚科。由于地区差异使蚊在形态上可能出现变异,有效形态特征比较有限,以及表型可塑性和遗传可变性的存在导致蚊的分类研究形成物种同物异名,如:1赫坎按蚊复合体是我国最复杂的种团。我国从1975年以来共记述了9个新种,这些新种的记述主要根据形态、甚至微小的区别,因而有的已确定为一种的同物异名。以上特征虽然是一般蚊