优化红景天的提取工艺

第一章文献综述1.1红景天的概述红景天[1-6]又名为蔷薇红景天，扫罗玛布尔[7]等；是一种寿命超过两年的常绿草本，属药食同源[8]。其比那些没有明显的主干部分，较为矮小而且丛生的植物更为短小，枝条部分趴伏在地面上。红景天多生于高海拔地区，环境极为险恶，该地温度严寒，使得生长在该种环境下的红景天具有顽强的生存发展能力和独特的与环境表现相适应的能力。红景天的典型形态特征：根部壮硕，周身挺拔竖直。叶片长度一般在0.7cm~3.5cm之间，宽度一般在0.5cm~1.8cm之间。红景天的花冠与根部连接的部位高度在0.2m~0.3m之间。以下简述，目前已知红景天的种类及其主要组成成分：表1-1红景天的种类及其主要组成成分红景天种类主要化学成分薄叶红景天琥珀酸、没食子酸、小麦黄素、小麦黄素-7-氧-β-D-葡萄糖甙、胡萝卜甙等X马红景天β-谷甾醇、胡萝卜甾醇、小麦黄素、没食子酸、没食子酸乙脂、麦芽糖等高山红景天红景天甙、酪醇、多酚等圣地红景天红景天甙、咖啡酸、酪醇、没食子酸、没食子酸乙脂、β-谷甾醇、胡萝卜甾醇等大花红景天红景天甙、酪醇、焦梳酸、没食子酸、β-谷甾醇、大花红天素等狭叶红景天红景天甙、酪醇、β-谷甾醇长鞭红景天β-谷甾醇、胡萝卜甙、没食子酸、没食子酸乙脂、酪醇、β-谷甾醇-3-β-D-半乳糖甙、草质素-8-阿拉伯糖甙等四裂、云南、大紫、互生、深叶、小丛、长圆、优美、浅绿、异齿、谢氏红景天红景天甙蔷薇红景天红景天甙、酪醇、没食子酸、没食子酸甲脂、β-谷甾醇、酪萨维等唐古特红景天[9]酪醇、红景天甙、没食子酸等实际上，针对红景天的研究，历程已有数年。对于红景天中所含具体成分的探讨[10]，国内外学者已经先后于红景天药材中提取分离出四十余种活性成分[11]。其中的大分子物质主要包括甙类、香豆素类、黄酮类[12]和多种具有挥发性的脂类物质等。而经由进一步的物化性能检测又证实了红景天药材中含有多种具有极其重要的特定效应的微量元素，譬如铅、银、镉等共二十一种。另外，红景天中还含有微量人体本身（或别的脊椎动物）无法合成或合成速度不能餍足人体所需，必须从食品中摄入的氨基酸。1.2红景天的有效成分现代药理学研究证实了红景天苷、红景天素、酪醇等是红景天药材在疾病的诊断、治疗、症状缓解以及处理或疾病的预防中具有药理活性或其他直接作用的理化成分[13-14]。此中红景天苷作为最主要的活性药物成份而存在。红景天中主要理化组分的介绍如下：1.2.1红景天苷理化性能：红景天味道较为甘甜，在水溶液中的溶解度极高，易溶解于甲醇、乙醇等有机溶剂，但在乙醚溶液中溶解度低下。主要功效：张明发[15-17]等人研究了红景天苷对于神经系统的保护作用、对于心血管的保护作用以及其与苷元酪醇协同作用时所表现出来的抗击炎症、抗肿瘤和免疫调节功能；其具体机制在于红景天苷可以通过调节免疫系统功能从而干预体内细胞的代谢活力，如增效吞噬细胞活力的表达、改变细胞膜表面蛋白质的结构而引起体内细胞特异性的改变，达到增强机体免疫力的作用，抗击肿瘤细胞增生，降低癌症发生率。1.2.2酪醇酪醇是一种化学物质，分子式是C8H10O2。主要用途：用于化学药物的含量检测/组成审定/药物药理试验等等。溶解性能：在水溶液、苯中不溶解；微溶于饱和的一元醇甲醇、二恶烷等；此外，酪醇极易溶解于小苏打的水溶液中。另一方面，就红景天的化学组成而言，具体包括有：表1-2红景天的化学组成化学组成类别具体成分黄酮类槲皮素、山柰酚、花色苷、异槲皮苷等有机酸类熊果苷、酪酸、鞣花酸、没食子酸等多糖类[18]L-阿拉伯糖、D-葡萄糖等香豆素类香豆素、7-羟基香豆素、茛亭等挥发性成分1.3红景天的药理作用根据明代李时珍（东壁）所撰写的《本草纲目》，在书中草部第20卷中明确写有红景天药材可被誉为“草本上品”[19-20]。通过数年的研究证实，红景天药材是扶助正气，巩固根本，调节人体的抗病能力，预防疾病，强身健体即增强机体免疫力以及抵抗早衰、滋阴止咳的佳品。因此近年来国内外研制开发的红景天制剂、保健品及相关的饮料品类也同样层出不穷。具体说来，红景天的药理作用可总结如下：1.3.1增强机体免疫力红景天苷可以通过调节免疫系统功能从而干预体内细胞的代谢活力，如增效吞噬细胞活力的表达、改变细胞膜表面蛋白质的结构而引起体内细胞特异性的改变，达到增强机体免疫力的作用，抗击肿瘤细胞增生，降低癌症发生率。1.3.2消除忧郁感抑郁症是一种以患者情绪长时期处于低迷状态为典型表现的情感障碍性疾病。多项临床研究实验表明，红景天提取物中的活性成分具有显著的抗抑郁作用；其作用机制主要表现在：①调节单胺类神经递质传递和膜表面蛋白受体的基因表达；②增进神经元再生、维持神经系统的正常运行；③近年来的多项研究证实，海马神经损伤和炎症的因素是导致抑郁症发生的一大促因，红景天提取物中的红景天苷具有保护神经系统、促进受损神经修复以及抗击炎症等作用；1.3.3保护心血管红景天提取物中的活性成分对于有关损害心血管系统[21]的物质有一定的阻滞能力。具体说来，具有如下功效：①治疗冠心病：人们通过大量研究发现藏药红景天是防治冠心病的一种良药佳品。如通过动物（犬类）实验，利用红景天药材来哺喂动物（犬类）后发现，红景天可有效的缓解动物的心肌氧耗，减少心绞痛的发作以及心肌梗死。同时，在一些临床研究中也证实红景天具有改善血流、抑制血液中的血小板聚合，防止血栓形成从而堵塞血管。②治疗高血压：高血压是一种较为常见的慢性疾病，其主要表现为体循环动脉血压（通常简称做血压）的升高。毋庸置疑，使血压维持在一个正常的范围内是使机体血液得以稳定循环流动的前提。红景天防治高血压的作用机理主要体现在：红景天药材对于某种相对分子质量为140000的糖蛋白具有一定的抑制作用，而该种糖蛋白在患有高血压的病人体内常常具有很强的表达能力，促使机体血压的过度升高引发血液循环受阻，因此红景天具有防治高血压的能力。③对心肌细胞/心肌纤维的保护作用：如红景天药材的水提取液对“喘息定”造成的动物心脏的血液流量降低，导致心肌耗氧量降低，阻止心脏的正常工作在现象具有明显防御作用，可以保护心肌细胞受损，维持心脏的正常运转。④防治脑缺血性疾病：脑缺血性疾病是由于数种因素协同作用而引起的多个相应部位的血液供应不足，如大脑、小脑以及脑干，由此而引起一系列意识障碍、感知障碍、认知障碍等红景天提取物中的活性成分红景天苷可以防止人神经母细胞瘤细胞的程序性细胞死亡，防御神经元和神经胶质细胞的受损。⑤消散瘀滞的作用：红景天提取物可以顺畅血液，增高血液流动性，降低粘度。正因为红景天具有降低血液黏度、通畅血脉的作用，所以其具有攻散体内淤血之效。1.3.4具美白保湿、抗辐射之效红景天药材多生长于条件艰苦、温度严寒之地，因此为与生长环境相适应，其具有强锁水能力以及保水性。红景天药材美白作用[22-25]的机制主要是：红景天可以抑制与黑色素形成有关酶的活性，譬如某种对酪氨酸特异性的催化蛋白质磷酸化过程的酶。由此防止肌肤色素沉积，促使皮肤中有害物质的排出。1.3.5治疗老年病①提高记忆力和治疗阿尔兹海默症[26-27]（AD）：红景天提取物中的活性成分红景天苷防治老年痴呆症的主要机制在于：红景天苷可以阻滞线粒体功能障碍的发生，而阿尔兹海默病的早期发病特征即机体内氧化作用和抗氧化作用的平衡机制被打破，从而更加有利于氧化作用的发生，是自由基带给机体的一种消极作用。这种现象的产生就是由于线粒体功能障碍而导致，因此红景天在老年痴呆症发病的前期具有一定的延滞作用；同时，红景天提取物还具有提高记忆力的功效，其中位于大脑中的海马体作为机体内长期记忆的存续和转化定位的区域，对于记忆力的影响尤为重要。大量的文献资料报道说明，红景天提取物可以提高大脑中具有参与神经元生成、有助于轴突再生功能的某种神经细胞生长调节因子的含量，该因子可以提高人体反应能力以及加强机体神经系统反应能力的速度和质量。②抗击轻度抑郁（患病者多为55岁以上的老年人）；③抗自由基及延缓衰老；1.4红景天的提取技术1.4.1醇提、水提法前有提及，目前已知红景天药材品类繁多，实际上红景天生长的地理位置也极其的广泛。何宝佳等人[28]对来自于不同生长环境下的红景天中活性成分的提取工艺进行了研究，通过测定红景天提取物中的活性成分红景天苷的提取率来作为衡定条件，他们利用不同的提取溶剂对不同产地的红景天进行提取，最终的结果表明以60%乙醇作为提取溶剂时红景天苷的提取率达到了峰值，之后分别是醇提法（以90%乙醇、甲醇、30%乙醇作为提取溶剂）、水提法；综上可得，当提取溶剂的分子极性逐渐降低时，生长在不同环境条件下的红景天中红景天苷的提取率会随之而增大，同时本实验也说明了醇提法的提取效率要略高于水提法；但是在实际提取过程中发现，若利用醇提法对活性成分进行提取时，在药材表面会出现类似油被分散在水中后而产生的形态；由此使得出现了随着生产时间的延长，提取率不增反减的现象。目前常用的红景天苷提取工艺常利用先在室温下浸泡，然后进行热回流浓缩的手段；虽然该法尤为简便，适合于工业化大生产，但是这种方法对于醇溶剂的消耗量较大，提取时间长且产品纯度无法得到保证；因此，除却传统的提取工艺手段（如水提法、醇提法等），为迎合在实际生产过程中某些红景天衍生产品的纯度要求，同时为进一步提高红景天中活性成分的提取效率，研究者们正在拓展越来越多的新型提取工艺；1.4.2微波破壁法微波技术[29-31]主要依靠辐射能来发挥作用，当其应用于耐高温物质的分离提取时拥有明显的优势，表现在超声提取后的结果分析过程中具有的操作过程简单、成效快的优点。王威等人对于高山红景天提取工艺优化的实验，当从高山红景天的营养器官即根部和生枝长叶开花的茎部中提取其活性成分红景天苷时，利用70%乙醇作为溶剂热回流2h和利用微波处理1.5min水提10min时所得到的红景天苷含量相似；同时此法还可以明显的减少提取液中杂蛋白的含量，利用微波破壁法最后得到的杂蛋白是普通醇提法杂蛋白含量的62.5%。苏波等人通过正交实验法证实，微波能具有提高红景天苷提取效率的作用，其影响力高于去离子水浸泡时间的长短以及超声波振动时间；在前期处理过程中利用微波加热的手段可以显著提高红景天苷的收率，该法同样适用于多种传统中药材的提取，值得推广。1.4.3超声波提取技术超声波提取技术的优点很多，譬如实验过程中的操作十分简便、所产生的废料及污染物极低等方面，而且超声波提取技术可以提高红景天提取的效率，促使其活性成分的加速度溶出，减少时间消耗。1.4.4高压提取法红景天的高压提取法是利用某种技术对红景天药材给予高压条件下的处理，使药材中的活性成分充分的排解出来，由此获得红景天提取物的一种方法。与利用辐射能才可以进行工作的超声方法相比较，该法有效的防止了有害的辐射能量对于机体的损伤，而且红景天苷的提取率也较高，更适合应用于工业生产之中；1.4.5大孔吸附树脂法大孔吸附树脂法如今已经广泛应用于传统中草药材的提取分离中，其具有很多得天独厚的优势，例如污染少、清洁力强，树脂可以重复多次使用（节约原材）、提取效率高等；1.4.6鞣质/单宁去除工艺一些结构较为复杂的多元酚类物质的存在对于红景天水提物的澄清透明度和味道有一定的作用，而经过大量研究证实，明胶溶液可起到沉淀鞣质的作用，使溶液中的悬浮物质聚集沉淀，提高红景天水提物的透明度和纯度。1.5方法学考察及其内容1.5.1线性关系的考察拥有一个线性相关关系是对一个物质得以定量测定的前提条件。符合上述说法的实验过程，例如测定某种混合物质中杂质的含量，则需要建立一定的线性相关关系方可较为精确的得到所测含量的结果。图1-1红景天苷标准曲线[注]图中方程为Y=1161.4.6x-10.21，R2=1。说明红景天苷标品0~0.55mg/ml的范围内具有较为良好的线性相关关系。1.5.2精密度实验

精密度可认为是在具有一定前提条件的实验环境下，经由数次的平行实验所得到的一一对应的多个结果，这些实验结果之间相似程度的大小即可认为是该实验所具有的精密度大小。1.5.3稳定性实验表1-3稳定性实验结果时间间隔（h）0.01.02.04.08.0峰面积440.8458.2437.5442.3450.4标准偏差8.38RSD（%)1.88[注]由表1-3可知，在每经过1小时则测定一次的时间间隔的条件下测定红景天苷的含量，在8h之内差别极微，数据基本没有较大起伏，其RSD值为1.88%。1.5.4重复性实验表1-4重复性实验结果序号12345峰面积395.4394.2396.5397.2399.9标准偏差2.15RSD（%)0.54[注]由表1-4可知，通过高效液相色谱法记录红景天苷的峰面积，进而分析实验室同一批红景天药材中的红景天苷含量的相关数据，得到其RSD值为0.54%，说明该检测方法的重复性良好。1.5.5加样回收率实验表1-5加样回收率实验结果编号样品含量/μg加入样品量/μg混合样品含量/μg回收率%平均值%RSD%114.25.619.598.4898.920.56214.28.422.398.67398.43414.214.028.199.65514.216.830.899.35[注]由表1-5可知，按照本文中所得到的红景天的最佳提取条件，样品的平均回收率为98.92%，RSD值为0.56%，因此说明测定得到的数据可信，该提取方法具备可行性。

第二章实验部分2.1仪器与试药2.1.1仪器旋转蒸发仪（N-1100，上海爱朗仪器有限公司制造/东京理化器械（株）独资工厂），真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），超声仪（KQ-5200DE，仪器编号20140707，昆山市淀山湖镇）；高效液相色谱仪PerkinElmerA-10Solvent&sampleModuleAltus和Agilent1100series；电子分析天平METTLERTOLEDO；超纯水制水机ADRONASIANO:5195；2.1.2试药红景天苷对照品（北京北纳创联生物技术研究院，10338-51-9），实验中使用的每批红景天药材均有检验合格报告。甲醇（色谱纯，lot：166578）赛默飞世尔科技（中国）有限公司；水（超纯水）ADRONASIANO:5195制。2.2实验方法2.2.1简述本实验主要分为两个阶段，第一阶段采用单因素单水平分析，初步选择提取红景天中有效成分红景天苷的适宜溶剂条件，其中包括将实验药材红景天进行预处理（将大块红景天样品掰碎，减少样品表面积以便于同实验溶剂充分接触；在称量样品时应注意将药材颠倒混匀，尽量减少实验误差）、使用水、乙醇等溶剂萃取红景天中的活性成分红景天苷（醇萃取过程中，需要将乙醇按照一定的配比，加入回流器中进行热回流）；然后将回流后所得的液体趁热进行过滤（过滤过程中应保持过滤方式一致，即压榨时用力大小或直接选择自然过滤，以及保证等目过滤；一般要进行3次以上的过滤），过滤结束后，将滤液合并，转移至石英坩埚熔金碗中；对合并后的滤液在恒温水浴锅中先进行24h左右的水浴加热，将其浓缩至膏状后转移至真空干燥器中进行减压干燥，从而获得红景天苷固体样品；提取率=样品质量/干药材质量*100%第二阶段参考第一阶段获得的实验结果，选择影响水提、醇提过程中实验结果的典型条件，进行多因素多水平的正交试验设计[32-37]；使提取工艺更具科学性、可控性。2.2.2高效液相色谱条件柱温：25℃

流动相：甲醇：水=15:85

检测波长：275nm

进样量：5μL

流速：1.000mL/min（1）检测波长的确定在200~400nm波长范围内，进行紫外扫描；扫描结果表明红景天样品在275nm波长处具有最大吸收峰，因此确定在本试验中的检测波长为275nm；（2）提取溶剂的选择取相同质量的药材，采用不同的提取溶剂或相同类别提取溶剂采用不同的浓度对红景天作提取，即分别对红景天药材采用水提、50%醇提、60%醇提、70%醇提以上四种实验条件，并用高效液相色谱法测定红景天苷的提取率。实验所得结果见表2-1。（3）水提方案的设计取200g红景天样品（将原药材掰成小块，混合均匀），进行初步水提（溶剂用量为2000ml水即10倍水，在加热介质上升温），将样品反复提取三次后，合并滤液转移至水浴锅中直至滤液浓缩为膏状物质，最后通过真空干燥器进行减压干燥后即可获得红景天苷固体样品。（4）醇提方案的设计先将实验室95%乙醇调配成50%、60%、70%的乙醇溶剂（利用酒精计即可测定出乙醇浓度）；取300g红景天样品（将原药材掰成小块，混合均匀）与10倍量的50%乙醇于回流瓶中混匀（以下步骤与浓度为60%、70%的乙醇提取溶剂的处理方式相同），在水浴锅上进行热回流；1h后（待冷凝圆底烧瓶内经由水浴加热，散开菊花状气泡时，方开始计算时间）对所得的滤液进行回收，再次加入10倍量的50%乙醇进行提取，如此反复3次后，合并滤液，并对滤液体积进行定容。将所得滤液投入旋转蒸发仪，温度调整在60℃~80℃，旋转蒸发仪转速在60~80r/min。再将旋蒸所得的浓缩液收集，用水浴锅浓缩至膏状。最后将浓缩膏状物放入真空干燥箱，在温度65℃条件下进行减压干燥约8h以上，即可获得红景天苷固体样品。表2-1不同溶剂对红景天苷转移率的影响溶剂转移率水提0.68250%醇提0.7060%醇提0.7970%醇提0.71结果分析：通过表2-1不难看出，当乙醇溶剂浓度低于60%时红景天样品中红景天苷的转移率随着乙醇浓度的升高而增大，而当乙醇溶剂浓度高于60%时红景天样品中红景天苷的转移率则随着乙醇浓度的升高而减少，所以初步选择以60%浓度的乙醇溶剂作为最佳提取浓度；所以，在正交试验设计醇提方案中，选择50%醇提、60%醇提、70%醇提作为乙醇溶剂浓度的3个水平；在上述高效液相色谱条件下，最终获得的三类典型色谱图见图2-1、图2-2、图2-3。图2-1红景天苷标准对照品的HPLC图图2-2红景天苷水提取物的HPLC图图2-3红景天苷醇提取物的HPLC图2.2.3单因素试验联系实际中的工业生产条件，实验中选择液料比（即提取溶媒用量）、提取时间、提取次数、提取温度这四个因素作为对红景天苷提取工艺有影响的检测参数进行单因素试验；（1）液料比对红景天苷含量的影响在提取温度为80℃、提取时间为80min、提取次数为1次的工艺条件下，考察液料比对红景天中红景天苷提取率的影响，分别选择液料比为1:7、1:8、1:9、1:10、1:11的共五组实验条件对红景天作提取，并计算所获得的红景天苷含量；具体实验方案：取得红景天药材粗粉5份各0.5g，于电子分析天平上精确称量，加入不同倍量的乙醇（7倍量、8倍量、9倍量、10倍量、11倍量）作为溶媒回流提取1次，每份样品的提取时间约为80min，经过减压浓缩后置于真空干燥器中干燥至恒重，所得的固体样品用甲醇定容到50ml的容量瓶中，然后吸取样液注入到高效液相色谱仪的取样瓶中。最终获得色谱图，并记录红景天苷的峰面积，计算实验所获得的红景天苷含量；最终得到的实验结果如表2-2所示；表2-2液料比对红景天苷含量的影响实验编号实验液料比红景天苷含量（mg/g）11:718.221:820.431:920.741:1019.651:1120.6结果分析：由上述表2-2可知，在红景天苷的提取过程中随着液料比的增加，红景天苷含量首先呈现较为明显的上升趋势，即红景天提取率升高；但是当液料比增大至1:5以上时，提取所获得的红景天苷的含量反而有时会下降，并且增速也不再显著；故而，考虑到实际工业生产中的经济性要求，最终选用1:8作为试验最佳液料比；所以在后续进行的正交试验中选择1:6、1:8、1:10作为液料比的3个水平；（2）提取时间对红景天苷含量的影响在提取温度为80℃、料液比为1:6、提取次数为1次的工艺条件下，考察提取时间对红景天中红景天苷提取率的影响，分别选择提取时间为60min、80min、90min、100min、120min的共五组实验条件对红景天作提取，并计算所获得的红景天苷含量；具体实验方案：取得红景天药材粗粉5份各0.5g，于电子分析天平上精确称量，加入6倍量的乙醇作为溶媒回流提取1次，分别提取不同的时间即60min、80min、90min、100min、120min，经过减压浓缩后置于真空干燥器中干燥至恒重，所得的固体样品用甲醇定容到50ml的容量瓶中，然后吸取样液注入到高效液相色谱仪的取样瓶中。最后获得色谱图，记录红景天苷的峰面积，并计算提取获得的红景天苷含量；最终得到的实验结果如表2-3所示；表2-3提取时间对红景天苷含量的影响实验编号实验提取时间（min）红景天苷含量（mg/g）16019.228020.239022.3410022.5512021.9结果分析：由上述表2-3可知，在红景天苷的提取过程中随着提取时间的增加，红景天苷含量首先呈现较为明显的上升趋势，即红景天提取率升高；但是当提取时间增大至100min以上时，提取所获得的红景天苷的含量反而有时会下降，并且增速也不再显著；故而，考虑到实际工业生产中的经济性、时效性要求，最终选用100min作为试验最佳提取时间；所以在后续进行的正交试验中选择1h、2h、3h作为提取时间的3个水平；（3）提取次数对红景天苷含量的影响在提取温度为80℃、提取时间为80min、料液比为1:6的工艺条件下，考察提取次数对红景天中红景天苷提取率的影响，分别选择提取次数为1、2、3次的共三组实验条件对红景天作提取，并计算所获得的红景天苷含量；具体实验方案：取得红景天药材粗粉3份各0.5g，于电子分析天平上精确称量，加入6倍量的乙醇作为溶媒回流提取1次，每份样品的提取时间约为80min，然后分别回流提取1、2、3次，经过减压浓缩后置于真空干燥器中干燥至恒重，所得的固体样品用甲醇定容到50ml的容量瓶中，然后吸取样液注入到高效液相色谱仪的取样瓶中。最后获得色谱图，记录红景天苷的峰面积，并计算提取获得的红景天苷含量；最终得到的实验结果如表2-4所示；表2-4提取次数对红景天苷含量的影响实验编号提取次数（次）红景天苷含量（mg/g）1121.082221.123321.74结果分析：由上述表2-4可知，在红景天苷的提取过程中随着提取次数的增加，提取得到的红景天苷含量变化并不明显，即说明提取次数对于红景天提取物中红景天苷的含量没有显著的影响，综合实际生产过程中的经济性要求，最终选用2次作为试验最佳提取次数；所以在后续进行的正交试验中选择1次、2次、3次作为提取次数的3个水平；（4）提取温度对红景天苷提取率的影响在提取时间为80min、料液比为1:6、提取次数为1次的工艺条件下，考察提取时间对红景天中红景天苷提取率的影响，分别选择提取温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的共五组实验条件对红景天作提取，并计算提取率；具体实验方案：取得红景天药材粗粉5份各0.5g，于电子分析天平上精确称量，加入6倍量的乙醇作为溶媒回流提取1次，然后分别在回流温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的条件下进行提取，每份样品的提取时间约为80min，经过减压浓缩后置于真空干燥器中干燥至恒重，所得的固体样品用甲醇定容到50ml的容量瓶中，然后吸取样液注入到高效液相色谱仪的取样瓶中。最后获得色谱图，记录红景天苷的峰面积，并计算红景天苷的提取率；最终得到的实验结果如表2-5所示；表2-5提取温度对红景天苷提取率的影响实验编号提取温度（℃）红景天苷提取率%1404.22504.83605.44705.65805.9结果分析：由上述表2-5可知，在红景天苷的提取过程中随着提取温度的增加，红景天提取物中红景天苷的提取率也会随之而增大，但是增加幅度较小，提取率的后续变化并不明显，因此综合实际生产过程中的经济性要求以及生产效率来看，最终选用60℃作为试验最佳提取温度；2.2.4正交试验设计水提方案的选择以水为提取溶剂，选择加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）进行3因素3水平的正交试验设计L9(34)。见表2-6。共进行九组实验，每组实验各取50g红景天原药材，分别按照上述9种试验方案进行红景天苷的提取。并将所得到的提取液合并、再浓缩、过滤、以及定容至50ml后进行超声，达到高效液相色谱仪进样要求。在水提方案的正交实验设计中，加水量（A）取值可在：6倍水、8倍水、10倍水；提取时间（B）取值可在：1h、2h、3h；提取次数（C）取值可在：1次、2次、3次；具体实验设计见表2-6；表2-6水提方案的正交设计优化方案编号A/倍水B/hC/次数D161112622236333481235823168312710132810213910321由此分别测得上述9种提取方案所得到的红景天苷的峰面积如表2-7所示：通过比较表3中峰面积的大小，不难看出，采用方案5进行水提工艺时所得到的红景天苷峰面积最大。表2-7HPLC法检测9种方案中所得红景天苷的峰面积方案编号峰面积146175282610260536898524456551455872577466552558778999728460230195789623结果分析综合上述实验，工艺中的提取溶剂若选择水时，应当按照方案5所示条件进行提取，即采用8倍水，热回流提取3次，每次2小时即为最佳的提取方案。2.2.5正交试验设计醇提方案的选择（1）提取次数的考察通过关于提取次数的一项单因素试验，将同一个红景天样品连续提取四次，经高效液相色谱法检测后所得到的红景天苷的提取率分别为1.815%、0.121%、0.042%、0.003%；故分析实验结果后不难看出，连续提取两次后所得到的红景天苷的提取率可达到连续提取四次后红景天苷提取率的96%以上，而连续提取三次后所得到的红景天苷的提取率可达到连续提取四次后红景天苷提取率的99%以上；同时，综合考虑到实际工业生产的要求，本试验最终的提取次数确定为2次；（2）正交试验方案设计及实验结果根据红景天苷水提、醇提预实验过程所得的结果，最终确定在正交试验中选择对于转化率影响较大的三组指标即乙醇溶剂浓度、料液比以及提取时间作为考察因素进行3因素3水平的正交试验设计L9(34)。以通过高效液相色谱法测得的红景天苷含量作为考察指标；本实验所使用的因素水平详见表2-8，实验结果详见表2-9，方差分析详见表2-10；表2-8正交试验设计因素水平表水平编号乙醇溶剂浓度%（A）料液比（B）提取时间min（C）1501:8302601:10603701:1290表2-9醇提方案正交试验结果L9(34)正交表因素试验号1234红景天苷含量（%）ABCD溶剂浓度料液比提取时间11.001.001.001.0024.8521.002.002.002.0015.6231.003.003.003.0020.0642.001.002.003.0037.5652.002.003.001.0035.8762.003.001.002.0040.0273.001.003.002.0025.7383.002.001.003.0019.6593.003.002.001.0013.94K120.17729.38028.17324.887K237.81723.71322.37327.123K319.77324.67327.22025.757R18.0445.6675.8002.236表2-10正交试验方差分析表方差来源ABC误差E离差平方和636.89455.18558.0397.63自由度2.00002.00002.00002.0000F值83.5057.2357.610F临界值F0.05(1,2)=19.0000显著性P<0.05P>0.05P>0.05结论：对上述正交试验表2-9中的数据进行处理，由直观分析所得极差R可看出，影响红景天苷提取率的三个因素，其作用效果重要性排列为A>C>B；再进一步通过方差分析，得到乙醇溶剂浓度（A）的大小对于红景天苷提取率的影响尤为显著（P<0.05），而提取时间（C）、料液比（B）这两个因素的影响力相似。综合考虑各影响因素的K值以及工业大生产过程中的实际应用，最终确定利用乙醇作为溶剂对红景天苷进行提取时，最佳工艺条件是A2B1C1：即60%乙醇、料液比为1:8，热回流提取2次，每次30分钟；（3）最佳工艺的验证实验对经过正交设计实验优化后的最佳提取工艺条件进行验证，检验所得到的实验结果是否真实可信并具有一定的重复性，即在最佳提取工艺的条件下分别进行3次提取实验，所得实验结果见表2-11。表2-11最佳工艺的验证实验编号样品质量（g）红景天苷含量（mg/g）红景天苷平均含量（mg/g）RSD%（相对标准偏差）1321.2221.230.0272321.233321.23分析表2-11，红景天苷含量的RSD（%）小于1%，故可得到通过实验所获得的最佳工艺条件具有一定重复性；

第三章实验结论及展望红景天药材的开发和应用，目前已有较为丰富的实践经验。本试验以指导实际工业大生产为目的，选用红景天提取物中的主要活性成分红景天苷为检测指标，以醇提、水提作为基础研究手段，较为全面的对红景天的最佳提取工艺做了遴选。本试验主要分为两个阶段，第一阶段采用单因素单水平分析，初步选定了提取红景天中有效成分红景天苷的适宜溶剂条件、液料比、提取时间、提取次数以及提取温度范围；即通过实验证实利用60%乙醇作为溶剂，液料比为1:8，在60℃条件下热回流提取2次，每次约为100min的工艺条件下，红景天苷提取率较高。第一阶段的单因素试验为后续正交试验优化提供了水平范围。第二阶段利用影响水提、醇提结果的典型条件作为研究水平，进行了多因素多水平的正交试验设计；首先，以水为提取溶剂，选择加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）进行3因素3水平的正交试验设计L9(34)。实验证明若是利用水作为提取溶剂，则在使用8倍量水，热回流提取3次，每次约2h的条件下红景天苷提取率达到峰值。同样，当以乙醇作为提取溶剂时，选择乙醇溶剂浓度、料液比以及提取时间作为考察因素进行了3因素3水平的正交试验设计L9(34)。得到若是利用乙醇作为提取溶剂，则使用红景天样品8倍量的，60%乙醇作为提取溶剂，需经由热回流提取2次，每次提取过程耗时约30min为宜。综合上述实验，得到结论：对于红景天中活性成分红景天苷的提取，最佳工艺条件是利用60%乙醇作为提取溶剂，料液比为1:8，需经热回流提取2次，每次提取过程耗时约30min。为使实验结果更具准确性和可靠性，本研究还通过最佳工艺的验证实验，证实了本试验中获得的最佳工艺条件具有较高的重复性和科学性，为进一步高效合理的开发利用红景天资源提供了可靠的参考依据。毋庸置疑，对于中药制剂的提取工艺优化是研究中的重要步骤，同时也与提高实际工业生产效率密切相关。因此本研究对于红景天中活性成分红景天苷的提取工艺优化，对进一步开发红景天制剂是大有裨益的，将为一系列红景天衍生产品的开发提供技术指导和申报依据。

致谢本论文在张凤清老师的指导下，历经半年的时间而圆满结束。在这半年里，在论文的实验设计、撰写和修改定稿等过程中，都耗费了老师大量的心血。值此即将毕业之际，特向在学业上传道授业解惑，在生活上关怀备至的张老师致以深深的敬意和衷心的感谢！感谢所有食品教研室的老师，感谢他们一直以来对我的关心和帮助。同时感谢在大学期间所有的关心和帮助我的老师、同学、朋友们。在试验过程中，还得到了其他试验室老师的关怀和指导。他们从试验仪器的筹备、试验条件的创造到试验技术的指导，都给予了热忱的关怀和帮助，谨在此深表深深的谢意。同时还要特别感谢学长王旭东的细心指导，在实验过程中，他为我们解决了众多问题和困难，正是由于与他们在学习和生活上的交流及互相帮助，才使我不断的进步，较好的完成了毕业论文。同时也感谢我的同学张倩，刘慧慧等的帮助，和你们一起学习生活的日子我永远难忘，在这即将分别之际，祝你们今后的人生之路一帆风顺，你们的友谊是我一生的财富。同样也十分感谢同组同学对本论文的帮助。最后，衷心感谢化学与生命科学学院的各位老师，感谢你们在我大学期间对我的培养和教导。使我圆满的完成了大学学业。祝各位老师身体健康，工作顺利！

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