基因分析在Dystrophinopathy与Sarcoglycanopathy诊断中的作用

基因分析在Dystrophinopathy与Sarcoglycanopathy诊断中的作用

概念Dystrophinopathy是DMD基因变异导致的一组XR骨骼肌病，主要包括：DMD、BMD、女性DMD。Sarcoglycanopathy是SGCA、B、D、G基因变异、肌聚糖蛋白（sarcoglycans,SGC）缺陷导致的一组肢带型肌营养不良(LGMD2C-2F)。两组疾病临床表现相似：四肢近端肌、腰带肌无力、萎缩，腓肠肌肥大；血CK增高。临床及实验室检查不能鉴别。肌聚糖病各亚型对应基因及编码蛋白Dystrophin与Sarcoglycon关系Dystrophin与Sarcoglycon为细胞膜/骨架蛋白，通过Dystrglycon复合体相关联，两者结构与功能相互影响，其中之一缺陷导致另一蛋白的继发性缺陷。BMD、女性DMD、LGMD2C-F患者活检骨骼肌组织化学染色呈现肌营养不良病理像；相关单克隆抗体免疫组织化学染色，肌纤维膜Dystrophin蛋白和Sarcoglycan蛋白表达减弱，鉴别与分型诊断困难。研究目的建立BMD、女性DMD、肌聚糖蛋白病（LGMD2C-F）诊断与鉴别诊断程序（病理、分子生物）。入组标准我科遗传标本库中筛选符合下列标准的37例患者；进行性四肢近端肌、腰带肌无力；血CK增高；骨骼肌组织化学呈肌营养不良表现；免疫组织化学染色肌纤维膜上Dystrophin和/或Sarcoglycans表达减低。研究方法回顾性分析临床资料骨骼肌标本再次行组织化学、免疫组织化学染色病理分析；分子生物学研究；1.外周血/活检骨骼肌提取DNA2.DHPLC筛查DMD基因大片段缺失/重复3.SGCG、SGCB、SGCA、SGCD直接测序4.DMD基因直接测序。5.人类dystrophin变异数据库查询蛋白结构和功能区变化（http://edystrophin.）结果临床资料结果男29例，女8例发病年龄4-26岁（2例2岁就诊时无症状，查体发现肌酶升高）阳性家族史6例，符合XR，提示Dystrophinopathy；血CK：3例＜1000u/l

余1000-15000u/l2813骨骼肌MRI结果13例行下肢骨骼肌MRI检查：大腿前群肌受累最重、股薄肌受累程度最轻，半腱肌次之；小腿前群肌受累程度最小，后群肌中腓肠肌外侧头受累重。受累肌群分布无明显差别。肌肉病变程度与病程相关。骨骼肌活检病理结果组织化学染色可见不同程度变性、坏死、再生，结缔组织不同程度增生；免疫组织化学染色肌纤维膜Dystrophin和/或Sarcoglycans表达减弱组织化学染色(病例2)HEMGTNADHAcid免疫组织化学染色正常HEDYS-NDYS-CDYS-R病例2Sar-aSar-

βSar-

γSar-

δ正常病例2正常HEDYS-NDYS-CDYS-R病例9Sar-aSar-

βSar-

γSar-

δ正常病例9正常病例24HEDYS-NDYS-CDYS-RSar-aSar-

βSar-

γSar-

δ正常病例24免疫组织化学染色结果表分子生物学检测结果DMD基因大片段缺失28例；大片段重复1例DMD点突变1例SGC基因突变5例DMD、SGC基因均未检测到致病突变3例

女性DMD5例

肌聚糖蛋白病5例BMD24例3例未能明确诊断OF：Outofframe，IF：

InframeDHPLC结果（病例2、15）病例2病例15对照病例15对照病例15对照DMD基因点突变（病例19）对照病例195例SGC基因突变位点（病例6-10）肌聚糖病变异基因与缺失蛋白亚基关系结论(一)与DMD不同，BMD、女性DMD、肌聚糖蛋白病（LGMD2C-F）具有高度临床异质性（发病年龄、症状轻重、CK升高水平）；女性DMD会影响对遗传方式的判断；病初CK升高水平与症状轻重呈正相关，病程晚期CK水平下降；遗传性骨骼肌疾病具有选择性肌群受累特点-内表型,本研究中Dystrophinopathy与Sarcoglycanopathy骨骼肌受累肌群分布无差别。女性DMD发病机制1.倾斜的X染色体失活模式：正常X染色体失活率超过80%，使带有异常的基因的X染色体有活性；2.X、常染色体易位；3.单亲二倍体：患者的两条X染色体均为母源性；4.Turner综合征：患者的染色体核型为45，X，若该X染色体带有DMD致病基因，则该女性因没有正常X染色体的补偿作用而发病。Dysferlinopathy患者双下肢骨骼肌MRI讨论(二)病理诊断与基因诊断相结合：建议在分子病理诊断基础上行分子生物学检测。Dystrophin与Sarcoglycon蛋白部分表达，首先DMD基因片段缺失/重复筛查；SGC基因测序（4个亚基）；DMD基因点突变检测。本组中BMD大片段缺失多位于exon45-55，多为Inframe突变。本组3例未发现明确致病突变，可能为非编码区突变。阅读框架学说(reading-framerule)DMD/BMD临床表型取决于突变是否破坏翻译阅读框，--“阅读框架学说”。Outofframe–大片段缺失/重复突变造成阅读框改变，出现新的终止密