高浓度葡萄糖体外对胰岛细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

高浓度葡萄糖体外对胰岛细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

2型糖尿病是老年人的高病。葡萄糖相对不足引起的血糖是2型糖尿病患者最典型的临床特征。长期的高糖环境不仅与糖尿病患者的大血管和微血管并发症密切相关，而且可以导致胰岛细胞数量的减少和功能的受损，目前对这一现象的确切机制还不十分清楚。本研究利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）观察长期高浓度葡萄糖对大鼠胰岛细胞和小鼠βTc3（βtumorcell3）凋亡的影响，同时利用定量逆转录聚合酶链式反应（QRT-PCR）技术检测与胰岛β细胞凋亡密切相关的bcl-2和bax基因的表达变化，探讨长期高浓度葡萄糖引起胰岛细胞凋亡的分子机制，为阐明葡萄糖毒性的机制以及为糖尿病的治疗提供新的思路。1材料和方法1.1检测试剂和培养基2级SD雄性大鼠65只，体质量180～220g，由北京医科大学动物中心提供，小鼠胰岛β细胞瘤细胞系（βTc3）由丹麦诺和诺德公司研发中心提供。胶原酶V、dispaseⅡ、原位细胞凋亡检测试剂盒购自德国宝灵曼公司，培养基RPMI-1640、培养基DMEM、葡萄糖和多聚蔗糖-400(Ficoll400）为Sigma公司产品，TRIZOL和RT-PCR药盒等购自GIBCO-BRL公司，100bpDNA梯度标记物为PROMEGA公司产品。PCR仪为EPPONDORF公司产品，紫外凝胶摄像分析仪和图像分析软件均为BI0-RAD公司产品。1.2实验方法1.2.1dutp缺口末端标记的制备大鼠禁食16h后腹腔麻醉，暴露胰腺，结扎胰管，灌注胶原酶V，分离胰腺，37℃水浴消化，过筛后，Ficoll400梯度离心分离胰岛，置于DMEM培养基中，37℃含5%C02的饱和湿度培养箱中培养2～3d，胰岛贴壁后，用0.9%dispaseⅡ37℃消化，将消化后的胰岛细胞按1×105个/孔置于6孔板培养，预先在6孔板内放入灭菌的盖玻片，加入2mL新鲜培养液，培养5d后，分为对照组(11.1mmol/L)和高浓度葡萄糖组(高浓度组，25.5mmol/L)，每组10孔，分别加入含有相应浓度葡萄糖的培养液，共培养14d后，将盖玻片用4%多聚甲醛固定30min，然后作末端脱氧核苷酸转移酶介导的duTP缺口末端标记技术（TUNEL）测定。1.2.2tunel检测盖玻片tunel-4的传代方法制备将自液氮罐内复苏冰冻保存的βTc3细胞，每隔3～4d传代，在2～3代后，按1×105个/孔置于6孔板培养，预先在6孔板内放入灭菌的盖玻片，加入2mL新鲜培养液，培养1d后，分为对照组(11.1mmol/L)和高浓度组(25.5mmol/L)，每组10孔，分别加入含有相应浓度葡萄糖的培养液，2～3d换液1次，7～10d传代1次，共培养45d后，将盖玻片用4%多聚甲醛固定30min，然后作TUNEL测定。1.2.4总rna提取将消化后的胰岛细胞2×106个/皿置于直径9cm细胞培养皿中培养，培养5d后，每皿加入10mL相应的培养液，培养14d后，用TRIZOL溶液，按试剂说明提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定总RNAOD260/OD280比值，-80℃保存待测。1.2.5总rna提取将复苏后的βTc3细胞每隔3～4d传代，大约传2～3代后，按2×106个/皿置于直径9cm细胞培养皿中培养，每皿加入10mL新鲜培养液，培养1d后，加入相应的培养液，2～3d换液1次，7～10d传代1次，共培养45d后，提取总RNA，于-80℃保存待测。1.2.6餐后血糖检测大鼠30只禁食16h后腹腔内注射STZ,剂量为35mg/kg,分别于注射STZ后7,14,21d从尾静脉以毛细血管法检测餐后血糖,21d后根据餐后血糖将大鼠分为2组,餐后血糖<11.1mmol/L组和餐后血糖≥11.1mmol/L组,另有1组正常大鼠(n=15)作为正常对照组,按照方法1分离大鼠胰岛,用TRIZOL溶液,按试剂说明提取细胞总RNA,用紫外分光光度计测定总RNAOD260/OD280比值,-80℃保存待测。1.3统计处理计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS10.0统计软件包进行统计学分析，组间比较采用t检验。以P<0.05为差别有统计学意义。2结果2.1浓度葡萄糖对原代大鼠胰岛tc-3细胞死亡的影响2.2高浓度葡萄糖对大鼠胰岛和t-3细胞死亡的影响2.3不同程度的高血糖大鼠胰岛死亡相关基因的发现3胰岛细胞凋亡的分子机制正常的、适度的葡萄糖环境可以维持胰岛细胞的正常生长分化和功能，而长期的、高浓度的葡萄糖则可以导致胰岛细胞数量的减少和功能的受损。本研究显示长期高浓度葡萄糖可以导致胰岛细胞的凋亡增加，提示高浓度葡萄糖确实可以产生葡萄糖毒性，通过使胰岛细胞的凋亡增加，来减少胰岛细胞的数目，进而导致胰岛功能的进行性衰竭，这与临床上2型糖尿病在发病早期以胰岛素抵抗为主，发病后期以胰岛素分泌的绝对不足为主相符。在胰岛细胞的进行性衰竭过程中，高血糖以外的因素也可能起作用，例如细胞因子、游离脂肪酸和胰淀素等。临床上观察到，部分血糖控制不佳的2型糖尿病患者，在经过严格的饮食和药物控制使血糖接近正常后，胰岛细胞功能可部分恢复，说明长期高浓度葡萄糖导致的胰岛细胞凋亡增加并不能代表葡萄糖毒性的全部机制，胰岛细胞分泌功能的可逆性受损可能在其中也有作用，其机制有待进一步研究。另外，因为目前制造糖尿病大鼠模型还没有其他更成熟公认的方法，本研究的结果尚无法完全排除链脲佐菌素的影响。胰岛细胞凋亡的分子机制目前国内外文献报道很少。自从1984年从淋巴瘤患者B淋巴细胞中发现bcl-2以来，陆续发现许多基因与bcl-2基因同源，现已成为1个家族。BCL-2蛋白位于线粒体内膜、核膜及内质网膜，主要作用是维护细胞生存，延长寿命。bax基因与bcl-2基因同属于bcl-2基因家族，与bcl-2基因有40%的同源性。BAX蛋白可与BCL-2蛋白结合形成异源二聚体，或自身形成同源二聚体，从而抑制BCL-2蛋白的作用，加速细胞死亡。有研究显示bcl-2家族mRNA表达的变化在胰岛细胞凋亡中起着重要的调节作用。本研究发现体外培养的胰岛细胞和β细胞系加入高浓度葡萄糖后，胰岛细胞凋亡增加的同时伴有bcl-2水平明显下降，baxmRNA的表达明显升高，致使bcl-2/bax比率明显减少。本文对低剂量链脲佐菌素糖尿病大鼠胰岛凋亡相关基因的表达研究也发现bcl-2/bax比率明显降低，上述变化在餐后血糖≥11.1mmol/L组尤为明显，可能与该组胰岛凋亡增加比餐后血糖<11.1mmol/L组更严重有关，提示bcl-2/bax比率变化可能在高浓度葡萄糖所致的胰岛细胞凋亡中起着重要的作用。本研究为2型糖尿病患者胰岛细胞的葡萄糖毒性机制提供新的解释。高浓度葡萄糖所致的胰岛β细胞凋亡增加在糖尿病的葡萄糖毒性中起着非常重要的作用，作用的机制可能为高浓度葡萄糖抑制胰岛细胞长寿基因表达和提高促凋亡基因表达，bcl-2/bax比率降低可能在葡萄糖毒性所致的胰岛细胞凋亡中起着重要的作用。本文提示通过饮食、运动和药物干预严格控制血糖水平，对保护胰岛β细胞，减缓2型糖尿病的进展具有十分重要的意义，并为糖尿病的基因治疗提供了新思路。运用反义技术阻断促凋亡基因，或将长寿基因转染至胰岛β细胞上，使该细胞能抵抗细胞凋亡，有望减缓2型糖尿病的进展。（致谢：本课题的大部分工作是在丹麦诺和诺德中国研究发展中心完成的，该中心不仅为本研究的顺利完成提供了有力的技术和实验设备的支持，同时还负担了该研究的大部分经费，在此对丹麦诺和诺德中国研究发展中心致以衷心的谢意。）1.2.3阴性细胞的复染应用TUNEL法检测,按原位细胞凋亡检测试剂盒说明操作。DAB显色凋亡阳性细胞后,再用苏木素复染阴性细胞核。每份样品于高倍镜下随机选取视野,计数100个细胞核,计算凋亡细胞百分率。1.2.7浓度葡萄糖对大鼠胰岛细胞和tc-3细胞内参照基因表达的影响取2.0μg总RNA以oligo(dt)12-18。为引物,在逆转录酶作用下合成cDNA第1链,用待检基因特异性引物在TaqDNA聚合酶作用下行PCR反应。首先确定待测基因PCR反应动力学参数,其中包括引物浓度,退火温度和PCR循环数等,在此基础上行PCR反应,反应产物在1.5%的琼脂糖凝胶中80V电泳90min,将电泳产物用紫外凝胶摄像分析仪和图像分析软件进行相对灰度分析(相对于β-actine,以%表示)。待测基因引物设计:bcl-2上游引物为5′-TGCACCTGAGCGCCTTCAC-3′,下游引物为5′-TAGCTGATTCGACCATTTGCCTGA-3′;bax上游引物为5′-CCACCAGCTCTGAACAGTT-3′,下游引物为5′-TCAGCCCATCTTCTTCCAG-3′,内参照基因β-actine(545bp)上游引物为5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA—3′,下游引物为5′-CTTCCTTAATGTCACGCACGA,TTTC-3′;PCR反应参数:95℃预变性2min,94℃,1min,55℃,1min,72℃,1min,共25个循环;最终72℃延伸7min。原代培养的大鼠胰岛细胞和传代的βTc-3细胞在含高浓度葡萄糖的培养液中培养后,凋亡细胞比例明显增加,见表1。大鼠胰岛细胞和βTc-3细胞经高浓度葡萄糖处理后,提取总RNA与对照组相比,baxmRNA表达明显增强(P<0.05),bcl-2mRNA表达明显下降(P<0.05),bcl-2/baxmRNA表达比率明显下降(P<