不同来源益生素对仔猪分泌型免疫球蛋白a和肠道菌群的影响

不同来源益生素对仔猪分泌型免疫球蛋白a和肠道菌群的影响

益生素是一种新型的微生态细菌制剂，广泛应用于动物和家禽养殖。它不仅具有抗逆性和促进生长的作用，而且避免了抗逆性的缺点。这些益生素主要包括宿主体内的原籍菌,如:双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、大肠杆菌等,以及部分外籍菌,如芽孢杆菌。其中乳酸杆菌是应用最早、研究最多的益生素之一。芽孢杆菌是应用最广泛的一类饲用益生素。但是对益生素的作用机理及其对宿主免疫功能的影响研究还比较少,尤其是原籍菌和外籍菌在仔猪体内的免疫促进作用和对肠道主要细菌的影响,以及它们之间是否存在差异,在国内外均未见报道。本试验比较了猪源约氏乳酸杆菌和外源枯草芽孢杆菌对仔猪肠道分泌型免疫球蛋白A(SIgA)和正常细菌的影响,为益生素在养猪生产上的合理应用提供一定的理论和试验依据。1材料和方法1.1试验材料1.1.1试验设计与日粮1~3日龄杜×长×大健康仔猪72头,成都蓉都养殖有限公司提供。根据遗传性状、体重、日龄和性别将仔猪随机分为3个处理组,每个处理设3个重复,每个重复8头猪。试验饲粮分别为:①基础饲粮(对照组);②基础饲粮+0.1%约氏乳酸杆菌JJB3;③基础饲粮+0.1%枯草芽孢杆菌JS01。基础日粮参照NRC(1998)猪营养需要设计,采用玉米-豆粕基础日粮,消化能13.44MJ/kg,粗蛋白质21.1%,赖氨酸1.452%。猪舍温度(29±1)℃,试验猪自由采食和饮水,饲养管理和免疫程序按照常规进行。1.1.2细菌、沙门氏菌约氏乳酸杆菌JJB3,分离自健康仔猪降结肠肠壁,耐酸耐胆盐,拮抗致病性大肠杆菌和沙门氏菌,活菌数为1.5×109CFU/g,四川农业大学动物微生态研究中心提供。枯草芽孢杆菌JS01,分离自土壤,活菌数为1.0×109CFU/g,四川农业大学动物微生态研究中心提供。1.1.3选择性培养基选择性培养基按文献配制。1.2测试指标和方法1.2.1益生素混食5日龄开始用所配饲料进行诱食,10日龄之前试验组每头猪每天灌服2g益生素,对照组灌服2mL生理盐水。10日龄之后将益生素按0.1%比例拌入饲料自由采食。28日龄断奶。试验期35d。1.2.2粪样的采集分别于仔猪7、14、21、29和35日龄在每重复组中随即选择2头仔猪,采集新鲜粪样2份,每份5g左右,置-70℃冰箱保存备用。一份用于检测粪样SIgA,另一份用于检测肠道菌群。1.2.3粪样中siga检测采用Bethyl公司(美国)的猪IgA双抗夹心ELISA定量试剂盒检测粪样中SIgA,按试剂盒说明书进行操作。96孔酶标板为Gene公司产品,酶标仪(680型)为Bio-Rad公司产品。1.2.4菌落计数及活菌数测定肠道菌群变化参照文献测定,即准确称取均匀混合的0.5g粪样,用生理盐水10倍递增稀释至10-7,选取适当稀释度的稀释液在不同的选择性培养基平板上滴种,每个稀释度3个重复。然后分别进行厌氧培养或好氧培养24~72h,菌落计数并计算每克粪样的活菌数(lgCFU/g粪样)。乳酸杆菌、双歧杆菌、消化球菌、肠球菌、梭菌和大肠杆菌分别用MRS、MRS+X-gal、PS、EC、CD和EMB选择性培养基培养计数。1.2.5生产力试验仔猪分组后记录初生重量,在35日龄试验结束时称重,计算各处理组仔猪日增重。1.2.6腹泻指数的测定试验期间每天观察仔猪腹泻情况,并按照表1的标准评分,计算腹泻指数,即腹泻头次乘以相应的腹泻得分。1.3方差分析和t检验试验数据均采用SPSS13.0统计处理软件进行方差分析和配对T检验分析,差异显著者用Duncan氏新复极差法进行多重比较。数据用平均值±标准差表示。2结果2.1枯草芽孢杆菌对7.采用双抗夹心ELISA试剂盒分别检测7、14、21、29和35日龄仔猪粪样中SIgA含量。由表2结果看出,同一日龄不同处理组仔猪的粪样SIgA含量差异不显著,但是,从7日龄开始,各试验组和对照组SIgA水平都呈下降趋势,尤其是29日龄断奶至35日龄期间SIgA水平显著降低(P<0.05)。对照组在21~29日龄,SIgA水平显著低于7日龄(P<0.05)。枯草芽孢杆菌组仔猪在7~21日龄之间抗体水平下降不显著,只是29日龄抗体水平显著低于7日龄(P<0.05);与其余组相比,虽然差异不显著,但是SIgA含量低于对照组和约氏乳酸杆菌组。约氏乳酸杆菌组在7日龄至29日龄期间,抗体水平变化不明显,差异不显著,29日龄断奶时,抗体水平高于其他2个处理组,但差异不显著。该结果说明枯草芽孢杆菌和约氏乳酸杆菌虽然不能改变仔猪从出生到35日龄期间SIgA水平下降的趋势,但是均可以延缓仔猪断奶前抗体水平下降的速度,而且约氏乳酸杆菌的效果优于枯草芽孢杆菌。2.2添加约氏乳酸杆菌对大鼠肠道梭菌数量的影响仔猪粪样中主要细菌含量的检测结果见表3。随仔猪日龄增加,3个处理组的粪样中大肠杆菌数量均呈下降趋势,29日龄前不同处理组没有显著差异。35日龄对照组仔猪大肠杆菌数量显著高于约氏乳酸杆菌组(P<0.05),与枯草芽孢杆菌组相比,虽然差异不显著,但是大肠杆菌数量更高。随仔猪日龄增加,肠球菌数量也逐步减少,只是在断奶后约氏乳酸杆菌组有短暂的增加,显著高于对照组(P<0.05),枯草芽孢杆菌处理组也高于对照组(P>0.05),但是很快又都回复到比对照组低的状态。饲喂枯草芽孢杆菌和约氏乳酸杆菌可显著增加7、14和29日龄仔猪肠道梭菌数量(P<0.05),但是对35日龄仔猪影响不显著。在7日龄和21日龄时,添加约氏乳酸杆菌的处理组消化球菌的数量显著高于对照组(P<0.05),在14日龄和29日龄高同一行数值肩注大写字母不同者表示差异显著(P<0.05),同列数据肩注小写字母不同者表示差异显著(P<0.05),未标注或字母相同表示差异不显著(P>0.05)。下表同。Inthesamerow,differentcapitallettersuperscriptsmeansignificantdifference(P<0.05).Inthesamecolumn,valueswithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(P<0.05).Valueswithsamelettersuperscriptsornosuperscriptsmeannosignificantdifference(P>0.05).Thesameasbelow.于对照组,但差异不显著,说明添加约氏乳酸杆菌,可以提高肠道消化球菌的数量;枯草芽孢杆菌组虽在大多数时间高于对照组,但差异不显著。添加枯草芽孢杆菌和约氏乳酸杆菌可以显著增加7日龄仔猪肠道乳酸杆菌(P<0.05),28日龄断奶后虽无显著差异,但试验组均高于对照组,说明添加枯草芽孢杆菌和约氏乳酸杆菌可以改善仔猪断奶后肠道乳酸杆菌的数量。虽然双歧杆菌在整个试验期变化不显著,不同处理组差异也不显著(P>0.05),但是2个试验组仔猪断奶后肠道的双歧杆菌数量均高于对照组。2.3乳酸杆菌对金鱼体重的影响由表4看出,不同处理组初生体重差异不显著,35日龄时,约氏乳酸杆菌组仔猪体重显著高于对照组(P<0.05),枯草芽孢杆菌组与对照组相比,差异不显著,但体重比对照组高。枯草芽孢杆菌和约氏乳酸杆菌组仔猪日增重都显著高于对照组(P<0.05)。2.4两组患者的腹泻指数比较在整个试验期内,对照组、枯草芽孢杆菌组和约氏乳酸杆菌组的腹泻指数分别为1.61±0.13、1.04±0.06和1.08±0.08。枯草芽孢杆菌和约氏乳酸杆菌处理组的腹泻指数显著低于对照组(P<0.05);而枯草芽孢杆菌组和约氏乳酸杆菌组间差异不显著。在整个试验过程中,对照组死亡率较高,而枯草芽孢杆菌组和约氏乳酸杆菌组没有发生仔猪死亡。28日龄断奶后,对照组仔猪普遍出现了严重腹泻,枯草芽孢杆菌组和约氏乳酸杆菌组只是个别仔猪有轻微腹泻现象,而且很快康复。3外源芽孢杆菌对脏器组织siga的影响SIgA是黏膜免疫的主要效应因子,在局部抗感染过程中发挥关键作用。有学者认为SIgA滴度对乳酸菌、各种链球菌及沙门氏菌都呈现抗体活性,而且在生理条件下,机体内的原籍菌是刺激合成SIgA的重要物质。但也有学者认为,原籍菌群不易引起宿主产生抗体,即使诱生抗体,其滴度也远远低于外籍菌群诱生的抗体水平。尽管原籍菌群非经口接种可以产生抗体,但经口接种却不如外籍菌群具有更强的抗原性,如果将这2种细菌分别与无菌动物单项联系,发现原籍菌群不能诱导自然抗体的产生,而外籍菌群却可产生。本试验结果表明,从1日龄开始给仔猪饲喂原籍菌猪源约氏乳酸杆菌JJB3或外籍菌枯草芽孢杆菌JS01,对照组和试验组的SIgA水平在7~35日龄期间均呈下降趋势,同一日龄不同处理组之间差异不显著。Scharek等检测了粪肠球菌对初生仔猪SIgA影响,发现35~56日龄SIgA水平很低,到70日龄才开始增加,与本试验结果相似。有关双歧杆菌的研究也证明革兰氏阳性乳酸菌对啮齿动物肠黏膜或全身免疫没有激活作用。无论是原籍菌,还是外籍菌,对早期仔猪消化道SIgA抗体的滴度都没有显著影响。分析原因可能是仔猪出生后前5周,自身还不能产生SIgA,主要由母源抗体提供保护作用,随着仔猪日龄增加,母源抗体水平逐渐降低,肠道黏膜才逐步具备产生SIgA的能力。Scharek等报道,怀孕母猪分别饲喂粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌后,只有蜡样芽孢杆菌可以显著提高仔猪断奶前粪样SIgA水平,而粪肠球菌显著降低了仔猪断奶后1周的SIgA水平。说明尽早使用外源芽孢杆菌可以改善仔猪SIgA水平。本试验中的约氏乳酸杆菌JJB3是肠道原籍菌,粪样中SIgA的水平与对照组差异不显著,与Scharek结果相似。但枯草芽孢杆菌作为外籍菌也没有引起SIgA水平的明显改变,可能是由于饲喂周期较短,仔猪的SIgA水平变化主要是反映母源抗体改变,所以为了考察外籍菌对肠道黏膜免疫水平的影响,有必要延长饲喂周期,或在母猪怀孕期间就饲喂益生素,才能检测到外源益生素对仔猪自身产生SIgA能力的影响。总之,本试验结果提示,随着日龄增加,仔猪母源抗体水平逐渐降低,35日龄时母源抗体水平降到低点,而自身产生SIgA的能力尚未完全建立,所以仔猪在此期间免疫抵抗力较弱,需要加强饲养管理,尤其是在日粮搭配方面,可以通过营养调控的方式提高仔猪抗病能力。测定粪样中主要菌群的变化,可以反映消化道内微生物区系的状态。一般来讲,健康猪的粪样中各种细菌的比例基本保持不变;在病理状态下,如发生定位转移和感染等,粪样中的菌群比例会发生改变,引起微生态失调。本试验发现添加枯草芽孢杆菌和约氏乳酸杆菌可以提高厌氧细菌梭菌和消化球菌数量,尤其是在仔猪28日龄断奶后,梭菌的数量显著增加,而3个处理组的肠道需氧菌基本没有显著差异,只是在断奶后,添加枯草芽孢杆菌和约氏乳酸杆菌的处理组中大肠杆菌数量低于对照组。说明在断奶应激时,添加枯草芽孢杆菌和约氏乳酸杆菌,有利于维持肠道中需氧菌和厌氧菌的比例。Guo等给仔猪饲喂枯草芽孢杆菌MA139后,粪样中乳酸杆菌显著增加,大肠杆菌与对照咱相比数量减少。Scharek等也发现尽管益生素对仔猪没有明显的免疫激活作用,但是对肠道微生物群有影响。本试验发现,尽管枯草芽孢杆菌和约氏乳酸杆菌没有显著提高仔猪肠道SIgA水平,但是在防治腹泻方面发挥了非常重要的作用,说明益生素控制腹泻的原因可能不仅仅是刺激仔猪肠道分泌抗体的产生,还可能通过有益细菌与致病菌之间的相互影响,达到