分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)课件

第九章分子生物学研究方法(2)1分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)第四节 DNA重组技术一、目的DNA片段的获得二、载体（质粒、噬菌体、cos质粒、病毒）三、DNA酶切四、DNA的连接和转化五、重组质粒的筛选和鉴定1.质粒DNA的提取2.质粒DNA的纯化3.重组质粒的筛选和鉴定分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)DNA重组

DNA重组是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程。又称DNA克隆、分子克隆、基因操作。3分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)重组DNA技术史上的主要事件1967年第一次发现DNA连接酶1970年分离了第一种限制性内切核酸酶，发现了反转录酶1972年获得第一个重组DNA分子1973年完成第一例细菌克隆1975-1977年发明了DNA序列测定技术，1977年完成了全长5387bp噬菌体f174基因组测定1978年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素1981年获得转基因小鼠和转基因果蝇1983年获得第一例转基因植物1986年GMO首次在环境中释放1994年第一批基因工程西红柿在美国上市2000年完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定(1.2X108bp)2001年完成第一个人类基因组全序列测定(2.7X109bp)2005年中、美、日科学家联合完成水稻基因组全序列测定分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)第一个DNA重组子（PaulBerg,1972）EcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA5分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)DNA重组的一般步骤1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。6分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。7分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)酶

类功

能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团重组DNA实验中常见的主要工具酶分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)

生物基因组DNA

细胞mRNA反转录合成的单链cDNA

通过机械切割、核酸限制性内切酶消化等处理成适合克隆的DNA小片段通过PCR技术可以获得目的基因人工化学直接合成一、目的DNA片段的获得10分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)（一）特点

基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。二、载体在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。分子量尽可能小，多拷贝、松驰控制型。能插入较大的外源DNA片段。载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)多克隆位点lacZ’载体名称载体大小选择性标记基因多克隆位点(multiplecloningsites，MCS)指多个限制性内切酶的单一切点。由许多限制酶切位点组成，往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。12分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)（二）类型从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为：

克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。DNA克隆常用的载体有：

质粒载体（plasmid），如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等；噬菌体载体（phage）；柯斯质粒载体（cosmid）；单链DNA噬菌体载体（ssDNAphage）；噬粒载体（phagemid）；酵母人工染色体（YAC）；细菌染色体克隆载体（BAC）等。13分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)1.质粒载体是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。作为克隆载体的质粒应具备以下特点:①分子量小，稳定存在，较高拷贝数；②遗传标志；③内切酶点。14分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)（1）pBR322质粒载体123来源于pSF2124质粒转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tertr）来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）15分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)（2）pUC质粒载体氨苄青霉素抗性基因(ampr)大肠杆菌β-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码α-肽链的DNA序列位于lacZ基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点(MCS)区段，它并不破坏该基因的功能。来自pBR322质粒的复制起点（ori）16分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)（3）pMD19-T质粒17分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)2.噬菌体载体

（1）噬菌体的生物学特性

溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。(烈性噬菌体只具有溶菌生长周期)

溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。(温和噬菌体具有溶源生长周期和溶菌生长周期)18分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)（2）λ噬菌体A.生物学特性

组成：蛋白质外壳和线状双链DNA分子组成。

DNA长度为48502bp，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesiveendsite）。19分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)

温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。

复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制;

溶菌周期的早期是“θ”复制，晚期进行滚环复制

基因组成

DNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段。

20分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)B.类型插入型（Insertionvectors）这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。如：λgt10、λgt11

克隆能力小，不到10kb置换型（Replacementvectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段是λ噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如：Charon4载体克隆能力大，20～25kb21分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)（3）M13噬茵体单链闭合环状噬菌体只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约6.4kb，可分为10个区和507bp基因间隔区（IS区），该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用作单链DNA载体的重要前提。22分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)复制与增殖M13(+)链DNA进入细胞内部合成出互补的(-)链DNA,此双链形式的M13DNA，称为复制型DNA。按θ形式进行几轮复制之后，基因Ⅱ的产物便在RFDNA的正链特定位点上作切割反应，形成一个缺口。M13基因组利用大肠杆菌的DNA聚合酶I，以环形的MI3(-)DNA为模板合成M13(+)DNA。当DNA复制叉沿着模板DNA分子转移到复制终点时，在基因Ⅱ编码产物的作用下，新合成的(+)DNA便会被切除下去，并进一步环化形成单位长度的M13基因组DNA。23分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)3、柯斯质粒载体柯斯质粒(cosmid)又称粘粒，“cosmid”一词是由英文“cossite-carryingplasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点的质粒。所谓柯斯质粒其实是一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，具有与质粒相同的结构特点，为双链、环状DNA。24分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)柯斯质粒具有下列特点：①具有质粒载体的特性。②带有λ噬菌体的粘性末端(cos区)。③一个或多个酶切位点。④具有高容量的克隆能力。⑤非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装，因而有利于重组体的筛选。25分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)类型：（1）重组型病毒载体

（2）无病毒基因的病毒载体——复制缺陷型可复制型复制缺陷型4.病毒载体组成：（1）病毒复制和包装元件 （2）病毒基因 （3）插入的外源基因或元件 （4）病毒外壳/外膜26分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)优点：（1）利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； （2）复杂的装配过程由细胞完成； （3）不同的病毒载体具有不同的表达特点。27分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)常用的病毒载体的特点：病毒载体生物学特性适用范围反转录病毒载体

单链RNA病毒

8~10kb可感染分裂细胞；整合到染色体中；表达时间较长；有致癌的危险；Exvivo基因治疗；肿瘤基因治疗。腺病毒载体

双链DNA病毒

36kb可感染分裂和非分裂细胞；不整合到染色体中；外源基因表达水平高；表达时间较短；免疫原性强；Invivo基因治疗；肿瘤基因治疗；疫苗。AAV病毒载体

单链DNA病毒

~5kb可感染分裂和非分裂细胞；整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因；在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达较高；Invivo基因治疗；Exvivo基因治疗；遗传病基因治疗；获得性慢性疾病的基因治疗。HSV病毒载体

双链DNA病毒

152kb具有嗜神经性；可逆轴突传递；可潜伏感染；容量大；可感染分裂和非分裂细胞；神经系统疾病的基因治疗；肿瘤的基因治疗。分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)

根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。

Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。

Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。1.限制酶的类型三、DNA酶切29分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)Ⅱ型酶Ⅱ型酶就是通常指的DNA限制性内切酶.

它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段；

Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；

Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。30分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)同尾酶(Isocaudamer)

能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。具有不同识别序列的限制性内切酶,切割DNA分子后产生相同的粘性末端。例如：SalI与XhoI,BamHI与BglⅡ。所有平末端酶产生的末端均是相同的，但一般不把它作为同尾酶来研究。同裂酶(Isoschizomers)

来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同。比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生平末端，后者切后产生粘性末端。32分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)（一）DNA的连接

1.DNA连接酶通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，从而修复缺口或催化粘合完全分离的两个DNA片段。eg:T4DNAligaseT4DNA连接酶（需要ATP作为辅助因子）主要用于：（1）连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；（2）双链DNA分子间的平端；（3）在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。四、DNA的连接和转化33分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)2.粘性末端连接连接后可能出现以下问题：（1）载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA5’-端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；（2）插入片段可双向插入；（3）插入片段可多拷贝插入。34分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)3.平端连接平端连接的优点是可用T4连接酶连接任何DNA平端，这对不同DNA分子的连接十分有利。平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需较多的T4DNA连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（PEG）可促进平端连接反应。4.人工接头连接5.利用适配子连接35分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)（二）重组DNA的转化

1.转化（transformation）指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。接受转化DNA的菌株称为受体菌株。转化时，细菌必须经过适当的处理（如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂），使之处于感受态

—即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-，M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。36分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)常用的大肠杆菌菌株：

DH5aJM109TOP10常用的农杆菌菌株：

EHA105LAB440437分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)（1）将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。步骤：（2）与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。（3）立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。38分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)（5）涂布于选择性培养基中分离转化子。（4）在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)2.转染和感染感染：在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。转染：在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。40分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)五、重组质粒的筛选和鉴定（一）质粒DNA的提取1.细菌的收获含相应抗生素的液体培养基里培养→移至1.5ml离心管→离心沉淀细胞2.细菌的裂解（1）碱裂解法（2）煮沸法

从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。41分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)

碱裂解法提取质粒DNA

根据Birnboim和Doly（1979）以及Ish-Horowicz和Burke（1981）的方法修订而成的应用最为广泛的制备质粒DNA的方法之一。优点：收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。

基本原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。42分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。（二）质粒DNA的纯化43分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)上清液加入固体CsCl与EtBr溶液室温下超速离心(45,000rpm）16小时穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭缓冲液透析除去残余CsCl两倍体积冷乙醇沉淀DNA离心、洗涤、干燥氯化铯密度梯度离心法实验表明，在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。这种差别对质粒DNA的纯化是十分有用的。44分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)缺点

通过氯化铯-EtBr密度梯度离心法虽然可以得到高纯度、高质量的质粒DNA，但它操作复杂，需要价格昂贵的氯化铯和超速离心机设备，而且溴化乙锭又是一种致癌物质，如果操作不慎，不仅会造成环境污染，还会危及实验工作人员的身心健康。45分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)1.抗药性标志的筛选2.β－半乳糖苷酶系统筛选–蓝白斑筛选（三）重组质粒的筛选和鉴定

现在使用的许多质粒载体(如pUC系列、pBluescript、pGem和它们的衍生载体)都带有一个大肠杆菌DNA的短片段，其中含有β-半乳糖苷酶前146个氨基酸的编码信息及调控序列。在各自独立的情况下，pBS(pUC、pGem等)和DH5a编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5a融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。46分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)Lac+细菌，在生色底物X-gal的存在下被IPTG诱导形成蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性，显白色菌落。分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)3.菌落快速裂解鉴定法菌落裂解后去除蛋白，直接凝胶电泳检测4.通过聚合酶链反应筛选重组子123456空白PDs5′基因特异引物48分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)5.内切酶图谱鉴定6.菌落或噬菌斑原位杂交BamHⅠ/PstI1234

制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。

目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段，或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。49分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)第五节 基因分离技术一、克隆的概念二、克隆基因的分离1.应用核酸探针2.应用mRNA差别显示3.应用cDNA差示分析4.应用酵母双杂交体系5.基因的图位克隆法6.Microarray(教材p.182-187)50分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)一、克隆的概念克隆可以理解为复制、拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同。51分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)分子水平：DNA克隆，也叫分子克隆。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。细胞水平：指由同一个祖细胞（progenitorcell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。个体水平：指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。如：从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotictwins）便是属于同一克隆。分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)1.应用核酸探针分离克隆目的基因二、克隆基因的分离

把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆。这个过程叫做克隆基因的分离或筛选。

应用核酸探针分离目的基因的方法叫做核酸杂交筛选法。此法应用广泛，相当有效，尤其适用于大规模筛选。分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)2.应用mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)分离克隆目的基因

在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式，叫做基因的差别表达（differentialexpression）。54分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)3、应用cDNA差示分析法克隆基因

这种方法能够充分发挥PCR技术以指数形式扩增双链DNA模板的性质，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法特异性扩增目的基因片段。因为试验对象（tester）和供试探针（driver）在接受差示分析前均经过一个4碱基切割酶的处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息被扩增。每次t减d反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃复性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高。56分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)57分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)4、应用酵母双杂交体系克隆基因5、基因的图位克隆法58分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)6、DNA的Microarray59分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)InfectedIBLUninfectedIBL60分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)第六节 分子杂交技术一、Southern印迹杂交(DNA)二、Northern印迹杂交（RNA）三、斑点杂交（dotblotting）四、Western印迹杂交（Protein）五、原位杂交六、基因芯片七、酵母杂交技术61分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)杂交(hybridization)：两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。（注意与复性的区别）核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。62分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)

在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。

分子杂交是目前分子生物学最广泛应用的技术之一。利用此技术，可以求出特定基因的频率、基因组织的特点、基因结构和定位、基因表达等。电泳凝胶核酸印迹法斑点和狭线印迹法菌落和噬菌斑印迹法63分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)E.M.Southern于1975年首先设计出来的。材料： 尼龙滤膜 硝酸纤维素滤膜 二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）步骤：第一：将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印迹转移第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA探针进行杂交一、Southern印迹杂交(DNA)

64分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)SouthernBlotting的过程1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA3.固定胶中的DNA到膜上4.预杂交和杂交（放射性和荧光检测）5.结果检测分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)M1210×SSC转移缓冲液Whatman滤纸凝胶Whatman滤纸纸巾玻璃板重物支持物500g12与探针同源杂交的基因DNA片段基因组DNADNA酶切片段内切酶NC或尼龙膜NC膜或尼龙膜分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)

将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。二、Northern印迹杂交（RNA）67分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)68分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)三、斑点杂交（dotblotting）69分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)四、Western印迹杂交（Protein）70分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)Step2.SecondaryAntibodyrecognitionofprimaryAbStep3.ColorDevelopmentStep1.AntibodyRecognitionoftargetprotein/antigen分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)72分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)

组织原位杂交简称原位杂交（insituhybridization），是在细胞保持基本形态的情况下将探针注入细胞内与RNA或DNA杂交，杂交反应在载物片上的细胞内进行。

基本步骤是通过适当处理使细胞渗透性增加，探针进入细胞内与DNA或RNA杂交、冲洗等。用放射自显影或免疫酶法或荧光显示杂交结果。五、原位杂交（教材P175）73分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)LocalizationofDNALocalizationofRNA74分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)荧光原位杂交(FlorescenceIn-SituHybridization,FISH)

一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。FISH技术是将荧光基团标记特异性的DNA探针，再将标记了荧光信号的探针与待测样本进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数。分子生物学导论-分子生物学研究方法(2)研究DNA分子水平上的多态性RFLP(rest