锁阳种子萌发的研究

锁阳种子萌发的研究

寄生虫是自然界广泛存在的资源。许多寄生植物是我国传统医学宝库中重要的中草药来源,如菟丝子、列当、锁阳等。众所周知,植物种子萌发的基本条件是水分、温度和空气,然而寄生植物因其特殊的生活方式,即使其种子满足以上条件,也不一定顺利萌发。这主要是因为寄生植物独特的萌发特性——刚成熟的种子普遍存在休眠现象,成熟后如果先经过一段时间的湿热预培养,并在较近距离内有寄主(或非寄主)根系分泌物等外源萌发刺激物的诱导下,种子或可顺利萌发。因此,通过对寄生植物种子打破休眠,诱导萌发等因素的研究,了解寄生植物种子萌发适宜的环境条件、诱导其萌发的物质及促进其萌发的机理,可以为寄生植物与寄主之间建立寄生关系提供依据,同时对人工繁殖寄生药用植物奠定一定的理论基础。锁阳(Cynomoriumsongaricum)是一种根寄生的多年生肉质草本全寄生种子植物,其寄主主要为蒺藜科(Zygophyllaceae)植物白刺(Nitraria),及骆驼蓬属植物骆驼蓬(Peganumharmala)。在野外调查发现,锁阳在蒺藜科植物木霸王(Sarcozygiumxanthoxylon)上也有寄生。锁阳生于干旱沙漠地带及荒漠区的湖盆边缘和洪积、冲积扇缘地带的盐渍化沙地,主要分布于我国西北干旱地区的新疆、内蒙古、甘肃、宁夏和青海。传统的中药锁阳以其去花序的干燥茎入药,又名“不老药”、“金不换”、“沙漠人参”等。其味甘,性温,具有补肾阳、益精血以及润肠通便等功效。除药用价值外,由于锁阳含有大量鞣制及淀粉成分,可提炼栲胶,用于酿酒和饲料等,因此,锁阳具有重要的药用和经济价值。但由于近年来的过度采挖,使药源不断减少,锁阳野生资源已处于濒临枯竭的状态。为了解决供需矛盾,对人工种植的锁阳进行了研究,但由于锁阳特殊的寄生生物学特性,人工种植的寄生率极低。针对这种情况,笔者对锁阳种子的形态、胚结构、种子休眠和萌发的特性进行了初步研究,以便为深入了解锁阳寄生生长规律,提高锁阳人工种植的寄生率提供理论依据。1材料和方法1.1锁阳植株种子保存锁阳种子于2007-2009年采自甘肃张掖红沙窝荒漠生境中的野生锁阳植株上,种子置于低温(4℃)条件下保存。鲜白刺根于2009-2010年采自甘肃张掖红沙窝。1.2b其他化学成分亚氯酸钠(NaClO2)、碳酸钠(Na2CO3)、氢氧化钠(NaOH)、高锰酸钾、乙酸乙酯、氯仿、乙烯、乙醚、丙酮为分析纯;萘乙酸(NAA)为化学纯;赤霉素(GA3)纯度93%;激动素(6-BP)纯度98%;苄胺基嘌呤(BA)纯度98%。1.3种子预处理将经低温(4℃)条件下保存的锁阳小坚果浸泡于乙醚中30min,倒去乙醚,待种子表面乙醚完全挥发后浸泡于自来水中,使锁阳种子果皮充分软化。取浸泡处理后的带果皮种子,用细砂纸磨去果皮,在解剖镜下观察直至深红色种皮裸露为止,得到去果皮种子。1.4种子重量的测定从手工筛选出的未处理纯净种子中随机取1000粒为1组,做3次重复,计算平均值。1.5关于种子层的研究选取饱满未经处理过的成熟锁阳种子,解剖镜下切片,用Nikon显微镜观察拍照。1.6锁阳种子萌发选用白刺根浸提液及赤霉素(GA3)溶液,加入到去果皮后的锁阳种子中,置于人为设定的条件(在30℃恒温箱中每天放置8h,其余时间在室温黑暗下)下萌发。1.7种子消毒处理每组实验均经相应方法处理并消毒后的100粒种子,置于垫有2层滤纸的无菌培养皿中,定期补充水分,使培养皿内保持湿润。在30℃恒温箱中每天放置8h,其余时间在室温黑暗条件下萌发。定期在体视镜下观察种子萌动情况,4个月后统计最终萌发率。每种实验种子处理方法如下:1.7.1不同温度层积处理并附加激素培养分别在低温(4℃)和变温(4℃与25℃交替)条件下将种子砂藏处理60d后,用0.5%高锰酸钾溶液消毒5min,无菌水冲洗5次。再加入相同浓度的BA和GA3溶液。均设3个重复。1.7.2不同温度水处理并附加激素培养将种子浸泡于自来水中,分别在低温(4℃)和室温下(25℃)各处理30d后,用0.5%高锰酸钾溶液消毒5min,无菌水冲洗5次。再加入相同浓度的苄胺基嘌呤(BA)和赤霉素(GA3)。3个重复。1.7.3寄主白刺根浸提液处理称取新鲜白刺根20g,加20℃水160mL,充分浸泡24h,取提取液待用。提取液分原液和稀释10倍液,将原液和稀释10倍液分别加入经高锰酸钾溶液消毒后的种子中,每种处理设3个重复。1.7.4不同生化试剂处理用1%NaClO2溶液、15%NaOH溶液、10%Na2CO3溶液、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、氯仿、乙烯、萘乙酸,6-BP分别处理10~40min。每组均设3个重复。1.8数据处理和分析采用SPSS13.0进行差异显著性检验,多重比较采用LSD方法。2结果2.1种子的基本结构特征锁阳的果实为小坚果,近圆形,果皮坚硬,全部木质化,呈褐色,直径1.0~1.9mm。种子的千粒重为1.988g。2.2不同种子器官的生长特性成熟锁阳种子胚为球形原胚,没有胚芽、胚根及子叶的分化(图1A),胚胎发育分化不完全是其最重要的寄生生物学特性。胚体占种子较小的体积,约1/2。经过层积处理或水浸泡处理2个月后的种子,其胚的大小有所增大,胚体约占种子体积的2/3。锁阳种子胚内空间主要被胚乳细胞占据,芽管状器官在生长初期为乳白色突起,生长到一定长度后停止生长,并逐渐变为棕褐色,部分会出现顶部膨大(图1B)。不同种子产生的芽管状器官存在一定的差异,有的种子胚细胞全部分裂后变成类胚根状结构,可生长至种体长度的10倍左右(图1C,D);有的种子只有珠孔端的胚细胞伸出珠孔随即膨大,并停止生长(图1E)。此结构在水分充足的条件下可以延续生长5d左右。当它停止生长时,变成棕褐色,逐渐死亡(图1F)。经观察,此种胚根状结构粗细不等,生长形态呈直立、弯曲、螺旋等。在种子萌发过程中,芽管状器官的伸长、螺旋生长现象,可能是主动寻找寄主的表现。2.3种子发芽特性2.3.1种子萌发过程锁阳种子在经过不同温度层积处理或水处理后,加入相同浓度的BA和GA3溶液,分别进行去果皮和带果皮实验。结果显示,BA溶液对于锁阳种子的萌发没有作用。GA3对于锁阳种子的萌发有促进作用。如不加入GA3溶液,种子在经过层积处理或水处理后,均没有任何萌发迹象。如果加入GA3溶液,锁阳种子的萌发效果有所不同:层积处理不足2个月的种子,用GA3刺激后无萌发现象;层积低温4℃处理60d后的种子,加入GA3溶液,仅去果皮的种子萌发,最早萌发时间在第21d左右;层积变温4℃和25℃交替处理60d后的种子,加入GA3,同样仅去果皮的种子萌发,最早萌发在第19d前后;室温水25℃处理30d后的种子,萌发较晚,最早是在第91d前后,萌发率普遍较低;低温水4℃处理30d后的种子,萌发较早,最早开始萌发是在第21d。以上处理对带果皮种子均无作用,带果皮锁阳种子均不萌发(表1)。2.3.2不同原液和稀释10倍液对去果皮锁阳种子萌发作用的影响选用白刺根浸提原液和稀释10倍液,对锁阳种子进行萌发实验。实验结果经显著性差异分析可知,原液和稀释10倍液对去果皮锁阳种子的萌发作用均显著(P<0.05),种子萌发率分别达到10.3%和8.3%,开始萌发天数均在第20d前后(表2)。2.3.3不同试剂对去果皮锁阳种子萌发的影响用1%NaClO2溶液、15%NaOH溶液、10%Na2CO3溶液、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、氯仿、乙烯、萘乙酸、6-BP处理种子后,经显著性差异分析后发现,以上试剂单独使用,对去果皮锁阳种子萌发刺激效果不同。经乙烯处理后的去果皮锁阳种子萌发率与其他处理结果之间差异明显(P<0.05),带果皮种子全部未萌发(表3)。3讨论3.1锁阳种子萌发现阶段普遍认为,寄生被子植物从种子萌发到寄生于寄主是两个独立而又互相关联的阶段。前阶段产生类胚根状物,后阶段通过形成的吸器器官与寄主维管束相通,汲取寄主的水分和营养来维持自身的生长和发育。根据笔者对锁阳种子不同发育阶段种胚形态的观察,锁阳与其他寄生植物相同,种子在萌发前,胚没有进一步分化出子叶、胚芽和胚根,始终保持球形原胚。经后熟阶段及白刺根液、赤霉素(GA3)溶液或乙烯溶液等刺激后,锁阳种子开始萌发,珠孔端形成乳白色的小突起,该突起通过珠孔向外生长,产生芽管状器官,类似胚根的结构。这种结构的存活时间为5d左右,当锁阳种子萌发后,数天内如不能获得寄主的营养,便会死去。同时发现,在没有寄主根存在的情况下,锁阳种子的萌发过程只能进展到此类结构的形成,有关研究报道中也无吸器器官形成的现象。对于专性寄生植物来说,其种子主要通过识别寄主释放的异源识别物质而感知寄主的存在,并随之萌发维持其繁衍生长,即寄主释放的萌发识别物质导致寄生植物种子的萌发。相关研究发现,锁阳种子的萌发需要来自于寄主的萌发刺激物质,即GA3。笔者研究发现,外源GA3对于锁阳种子的萌发确有一定的促进作用,但其作用效力有待进一步确认。锁阳的寄主白刺根浸提液对于锁阳种子的萌发具有促进作用。实验显示,在加入白刺根浸提原液后,锁阳种子的萌发率最高,达到10.3%。由此推测,锁阳种子对于白刺的寄生,有可能是锁阳种子接触到白刺根后产生了一种物理信号的作用,这种信号诱发锁阳种子产生体内调节作用,从而导致种子萌发。3.2种子带果皮的开酵剂处理锁阳种子存在休眠现象,包括生理休眠和强迫性休眠。锁阳种子的生理休眠主要体现在两方面:其一为种胚休眠,胚的活力低下。其二为种子中存在萌发抑制物质。相关研究表明,该萌发抑制物质分布在锁阳的种皮内,为脱落酸ABA。锁阳种子的强迫性休眠主要是果皮所致,锁阳的果皮是由木质化的细胞组成,该结构对于种子的透水、透气性有一定的影响,并且果皮对于种子的萌发也有一定的机械束缚力。我们的实验结果也证明,种子带果皮时,任何处理几乎都不能使其萌发。从实验结果可以看出,同一批种子同时培养后,可以在不同时间陆续萌发,即锁阳种子存在生理性发育不整齐。所采集的锁阳种子,由于其生理发育情况并不完全相同,种子的休眠深度存在差异,同样的处理方法并不能同步解除所有种子的休眠。我们认为,锁阳种子休