中药复方对慢性约束性应激大鼠海马中总rna的影响

中药复方对慢性约束性应激大鼠海马中总rna的影响

根据研究数据，内源性氨基酸广泛参与靶场的调节，在中枢神经系统和免疫球蛋白之间发挥重要作用。在前一种实验中，作者发现在适当的适应过程中，身体的免疫功能显著降低。本实验对其发生的机理进行深入研究,旨在揭示慢性束缚应激产生的机理,以及中药复方抗慢性束缚性应激的机理。材料和方法1.动物和综合体、实验中的中药、模型方法和统计学处理参见已发表论文。2.试剂和机器2.1生物酶活性的研究TRIZOLReagent(Gibcol公司)、DEPC(Sigma),DNA分子量Marker(DL2000,Takara),λ/DNAHindⅢMarker(华美生物工程公司),TaqDNAPolymerase、dNTP(Promega),RT-PCR试剂盒(北京鼎国生物技术有限公司),氯仿、异丙醇(国产分析纯)。2.2主要的检测仪器2Κ15高速低温冷冻离心机、SEM-320型电泳仪、PCR仪、DF-C恒压恒流电泳仪、台式培养箱、恒温摇床、8823A型紫外检测仪、组织研磨器、FIT-5000凝胶图像分析系统。3.实验方法3.1rna的提取RNA的提取和含量的测定造模结束后,立即将大鼠断头处死。在冰盘上取双侧海马。100mg海马组织中加入1ml预冷的TR-IZOL,在组织研磨器中充分研磨,冰上放置5min。按说明书方法提取RNA。取约2μl总RNA样品,在1%琼脂糖,TAE缓冲系统中进行电泳。电泳条件为:恒压100V,电泳约20min。凝胶成像系统下观察28S、18S、5S条带的情况。取出适量RNA样品稀释成一定倍数(10或20倍),应用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。根据A260的值计算RNA浓度,并根据A260/A280比值计算其纯度,要求为1.8～2.0,比值低于1.7者弃去。3.2半定量pcr检测根据Genebank的序列,用Primer5.0软件分别设计了β-actin、脑啡肽(enkephalin,Enk)和前强啡肽(prodynorphin,Prod)的引物,由三博远志生物技术公司合成。其中β-actin作为半定量PCR的内参照。引物序列如下:(1)β-actin:上游引物:5ue78d-CATCTCTT-GCTCGAAGTCCA-3ue78d,下游引物:5ue78d-ATCATGTTT-GAGACCTTCAACA-3ue78d;(2)Enk:上游引物:5ue78d-ATG-GCGTTCCTGAGACT-TTGA-3ue78d,下游引物:5ue78d-TAGAGTTTTGGCGTATTT-CGGAGGC-3ue78d;(3)Prod:上游引物:5ue78d-ATGGCGTGGTCCAGGCTGATGC-3ue78d,下游引物:5ue78d-AGTTTGTAGATTTAGAAGCCTTATCC-3ue78d。分别扩增Enk基因(810bp)、Prod基因(747bp)。3.3反向转移反应3.4矿物油pcr反应PCR反应:取等量的RT-PCR产物,分别扩增β-actin、Enk和Prod基因。(1)50μl反应体系包括:RT反应产物6μl,10×PCRBuffer4.5μl,dNTP(10mmol/L)1μl,SensePrimer(Enk或Prod)1μl(50pmol),AntisensePrimer(Enk或Prod)1μl(50pmol),TaqDNA聚合酶1μl,DEPC-ddH2O35.5μl。同时,将Enk或Prod的引物换为β-actin的引物,其它反应体系与上述相同进行PCR反应。(2)混匀后离心,加入50μl轻质矿物油进行PCR反应。反应条件为:94℃预变性3min;94℃40s;52℃45s,72℃45s,进行30个循环;之后72℃再延伸15min。(3)PCR反应结束后,取10μl的PCR产物,同时选用DL2000核酸分子量Marker在1%琼脂糖凝胶上电泳,恒压100V,电泳约20min,以使产物充分分离,观察目的DNA的大小。3.5琼脂糖凝胶的图像分析PCR反应产物20μl进行核酸电泳,对经过电泳之后的1%琼脂糖凝胶用FIT-5000凝胶图像分析系统进行扫描分析,以在组织中表达稳定的β-actin条带作为内参照,用目的基因的光密度与内参照条带的光密度的比值为半定量分析数据。结果1.总氮电泳的结果2.各组enkmrna表达水平的比较由表1可见,7天模型组大鼠海马的ProdmR-NA的表达水平明显升高,与正常对照组比较P<0.01,EnkmRNA含量虽也有上升,但是与正常对照组比较无统计学意义。21天模型组的EnkmR-NA、ProdmRNA的表达水平都比正常对照组和7天模型组有明显的升高(P<0.01)。逍遥散组和四君子汤组的EnkmRNA的表达水平较21天模型组有显著降低(P均<0.01),金匮肾气丸组的EnkmRNA表达水平虽然较21天模型组有所降低,但是没有统计学差异。三个用药组都能不同程度地降低海马中ProdmRNA的表达,与21天模型组相比P均<0.01。逍遥散组的EnkmRNA和ProdmRNA的表达水平明显比金匮肾气丸组低(P<0.05,P<0.01)。脑啡肽对海马免疫功能的抑制作用内源性阿片肽是在哺乳动物脑中天然生成的具有阿片样作用的物质的一种,主要分为脑啡肽家族、内啡肽家族和强啡肽家族。有研究资料表明内源性阿片肽广泛参与应激的调节,并且在中枢神经系统和免疫系统之间起着重要的调节作用。作为内源性阿片肽的一种,脑啡肽在脑内分布广泛,它生成和释放后,通过内阿片肽受体发挥一系列作用,除了镇痛、调节心血管、呼吸和体温外,还有广泛的免疫调节作用,对正常状态下和应激状态下的机体免疫功能都有一定的影响。研究表明脑啡肽中的甲硫脑啡肽和亮脑啡肽都可影响正常人T淋巴细胞活性、花环形成率及自然杀伤细胞的活性。甲硫脑啡肽和亮脑啡肽可以明显抑制电击应激大鼠自然杀伤细胞毒的作用并能被纳洛酮阻断,说明机体内源性阿片肽样物质在应激刺激免疫功能中有重要作用。海马是内啡肽调节免疫的重要结构基础,而白细胞介素1α(IL-1α)则是它调节免疫的重要介质。研究表明,大鼠海马内微量注射甲硫脑啡肽或亮脑啡肽能明显增强刀豆蛋白A刺激的脾淋巴细胞增殖反应(小鼠的实验也证明了这一点),并且用RT-PCR技术证明了脑啡肽抑制脂多糖(LPS)诱导的大鼠海马脑区IL-1α基因表达,在离体培养的新生大鼠海马胶质细胞上,进一步证实这种作用,由于这种抑制作用可被阿片受体阻断剂纳洛酮所阻断,所以这种抑制性影响可能是通过作用于海马胶质细胞上的阿片受体所致。据报道,丘脑、下丘脑、海马、嗅球、弓状核、室旁核等神经元均有IL-1免疫活性物质及受体,以IL-1作下丘脑推挽灌流可促进肾上腺皮质激素释放因子的释放,通过垂体-肾上腺轴,进而抑制外周免疫功能。这些结果说明中枢内IL-1很可能参与机体免疫功能的负性调节。脑啡肽对海马胶质细胞IL-1基因表达的抑制性作用,解释了海马内注射脑啡肽增强机体免疫反应的机理,即脑啡肽通过作用于具有产生IL-1α能力的海马胶质细胞或某些神经细胞膜上的阿片受体,抑制IL-1α基因表达,从而减少脑内IL-1α合成,导致IL-1α对下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的激活效应减弱,并通过降低血液中肾上腺皮质激素的含量增强机体的免疫功能。但有些学者对脑啡肽的免疫调节作用有着不同的认识,他们认为脑啡肽对免疫功能的作用与剂量有关,即在小剂量可增强免疫功能,大剂量则产生抑制效应。但是脑啡肽对免疫系统的影响还可以通过交感神经来实现。有研究表明第三脑室内注射Met-Enk后引起脾淋巴细胞增殖的降低,但是这种效应并不是Met-Enk的外周效应。因为Met-Enk作为中枢神经递质,其血脑屏障的通透率很低,并且在血液中有大量的高降解能力的氨基肽酶,可以在很短的时间内将血液中的Met-Enk降解。所以可以认为这种效应是Met-Enk与第三脑室周围组织作用的结果。它虽不与外周免疫细胞直接接触,但可以通过作用于中枢的某些核团,改变核团神经元的兴奋性,再通过神经回路或神经内分泌回路影响外周免疫反应。Met-Enk的信号传递到免疫系统主要依赖于HPA轴或淋巴器官上分布的交感神经系统。已证明脾交感神经纤维末梢有可能与脾实质淋巴细胞之间进行突触样化学传递。所以MetEnk可以通过影响交感神经来影响机体的免疫功能。此外IL-2或干扰素(IFN-α)也可能在中枢内通过阿片受体途径影响脾交感神经兴奋性而最终调节脾淋巴细胞的增殖。本实验表明在慢性束缚应激7天时,EnkmR-NA在海马中的表达就有所上升,但是不甚明显,束缚21天时上升较为明显,与正常对照组和7天模型组比较P<0.01。Enk含量的上升会抑制中枢IL-1α基因表达,可能会引起脑内的IL-1α水平有所下降。逍遥散和四君子汤能够明显抑制海马EnkmRNA的上升,可能是它们增强机体免疫功能的重要机理之一。金匮肾气丸抑制EnkmRNA上升的效果不显著,但是它增强机体免疫力的作用十分显著,这提示机体免疫力的调节是通过多种途径进行的,Enk对免疫功能的调节只是影响免疫功能的途径之一。前强啡肽是内源性阿片肽家族的另一重要成员。在纹状体、海马和下丘脑中含量最高。前强啡肽mRNA的生成在许多脑区内均受某些状况影响,例如在新纹状体中,γ-氨基丁酸(GABA)可使其降低。海马中的前强啡肽mRNA则受点燃作用的下向调节。强啡肽具有极强的阿片活性,近年来研究发现急性脑出血患者血浆中有强啡肽A的增高,提示它可能是继发性中枢神经系统损害的重要因素之一。但是也有不同学者认为强啡肽A对脑缺血有保护作用,有研究表明侧脑室内注射强啡肽A,可使脑缺血大鼠大脑皮层水肿明显减低,同时皮层内Ca2+含量明显减低,而Mg2+含量增高。强啡肽A1-13还与机体的免疫功能调节有密切的关系,研究表明在大鼠烧伤应激后脾内强啡肽A1-13的含量明显下降。这说明强啡肽A1-13可能是通过脾脏上的阿片受体,引起机体免疫功能抑制的,从而也提示它能增强机体的免疫功能。分子生物学水平证实在慢性吗啡依赖大鼠海马、纹状体、下丘脑中前强啡肽原mRNA水平明显下降,这种变化可能是阿片类药物依赖和耐受的重要神经生物学机理之一。由上可见,强啡肽A发挥不同作用时所通过的途径也不同。强啡肽A另一个重要作用特点是它只在机体病理或损伤过程中起调节作用,对在正常状态下的大鼠影响不大。本实验表明,在慢性应激状态下海马内的前强啡肽mRNA表达有明显的上升,而且它的变化可能要比脑啡肽的变化早。从以前试验结果来看,在慢性束缚性应激状态下,强啡肽上升会对神经系统造成一定的损伤,因为脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养蛋白(NT3)的含量在应激时都有所下降,对神经系统的保护作用降低。上述三个复方都对应激大鼠有一定