微量热法提取板蓝根及其抑菌活性研究

微量热法提取板蓝根及其抑菌活性研究

板蓝根是蔷薇科植物的一种干燥的植物，具有抗寒性和苦味，具有清热解毒、凉血炎的功效。随着板蓝根的深入研究，从各种极性干燥剂中提取分离出板兰根水提取物和各种湿润干燥剂的提取过程中分离出越来越多的化学成分[1.3]，并发现了越来越广泛的药理作用。其中水生成分具有抗逆性、抗真菌和增强免疫作用。脂溶性成分在抗菌、抗血小板聚集、抗炎、减少细菌内毒素等方面发挥着非常重要的作用。以前的研究方法，如环腺炎法、试管稀释法和室外抗菌试验法，已经被用于评估板蓝根的抗炎性和活性部位，但未报告它们是否使用微热法对板蓝根活性作用、生物化学特征和活性成分的影响。微量热方法作为生物热力学的研究手段之一,以体系的状态参数为研究对象,可定量地测定生物机体生长代谢过程中以及中药与机体相互作用过程中的能量转移和热变化.该方法具有普适性好、灵敏、准确、实时、动态、在线和高通量的特点.大肠埃希杆菌(Escherichiacoli,E.coli),俗称大肠杆菌,是最常见的临床分析菌,在分子生物学和基因工程研究中,大肠杆菌是重要的实验材料,体外培养技术成熟,代谢热功率较大.武彦文等以大肠杆菌为试验对象,采用微量热法初筛了大青叶活性部分,于游等采用微量热法确定了中草药茵陈中不同浓度的有效成分药液对大肠杆菌代谢作用的最佳浓度,微量热法也被用来考察重组质粒对大肠杆菌HB101生长影响和分析aprE的基因表达.本研究以大肠杆菌作为测试菌,采用微量热法,考察板蓝根药材不同提取方法的水煎液及其化学萃取部位对大肠杆菌生长代谢的影响,初选板蓝根药材最佳的提取方法和抑菌活性部位,并求出了抑菌最强活性部位的最小抑菌浓度,为传统中药板蓝根及其它化学成分复杂中药的研究提供方法和试验基础.1实验部分1.1实验仪器及流程3115型TAMAirIsothermalMicrocalorimeter(瑞典ThermometricAB公司).该仪器配置PicoTC-80数据采集和分析软件,可同时独立测定8个样品.其热稳定性好,恒温工作范围为5~60℃,波动±0.02℃,热功率最小检测限为2µW,24h基线漂移不大于2×10-7W.其它有关仪器结构原理及操作详见文献,实验时系统控温度于37℃.TST98-1-B型电子控温加热套;KQ-500B型超声波清洗器;Laborota-4000型旋转蒸发仪.1.2蛋白饮料的制备菌株:大肠杆菌(EscherichiacoliCMCCB44103),由中国药品生物制品检定所提供.培养基:LB液体培养基,取NaCl5g,酵母膏5g,蛋白胨10g,溶解于1000mL去离子水中,调pH7.0~7.2后分装.121℃高压蒸气灭菌30min,冷却后置-4℃冰箱中保存备用.板蓝根产于安徽亳州,其饮片购自北京绿野药业有限公司,经解放军302医院肖小河研究员鉴定为十字花科植物菘蓝(IsatisindigoticaFort.)的干燥根.所有试剂均为分析纯.1.3实验方法1.3.1全石油醚不同萃取部位的分离.取板蓝根饮片适量,加10倍量去离子水煎煮2次,每次2h,合并药液,适当浓缩成浸膏.采用系统溶剂萃取法分级萃取,得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位及剩余水层原液和萃后部分.各萃取部位减压干燥得干膏.取干膏适量,加入适量无菌水溶解配制成25mg·mL-1溶液,用0.45µm的滤膜过滤除菌,备用.1.3.2样品回收法取板蓝根饮片适量,加10倍量去离子水回流提取2次,每次2h,合并药液,冷却后适当浓缩成浸膏,余下操作同“1.3.1”项.1.3.3超声法的制备取板蓝根饮片适量,加10倍量去离子水超声提取2次,每次2h,合并药液,冷却后适当浓缩成浸膏,余下操作同“1.3.1”项.1.3.4萃取部位对大肠杆菌生长代谢“p-t”曲线的影响采用安瓿法.在无菌条件下,向参比池各20mL安瓿瓶内分别加入5mL已灭菌去离子水作为参比;反应池各安瓿瓶中精确加入5mL培养基,接种大肠杆菌混悬液,接种量为1×106CFU·mL-1,然后迅速加入100µL水层原液和各萃取部位药液,使各安瓿瓶内药液最终浓度为0.5mg·mL-1,加盖瓶塞,密封,放入微量热仪中跟踪记录大肠杆菌生长代谢的“P-t”曲线,控温于37℃,当曲线重新返回基线时,实验结束.各萃取液作用下大肠杆菌生长代谢的“P-t”曲线见图1~3.1.3.5大肠杆菌在板蓝根中的产热功率大肠杆菌的生长繁殖过程共分为四期:停滞期、第一指数生长期、第二指数生长期、衰亡期,体现在出峰时间t、发热功率P和生长速率常数k的改变上.而在细菌的生长过程中,“P-t”曲线上指数生长期内的产热功率与培养时间之间符合公式:其中P0和Pt分别指细菌指数生长期初始点和t时的热功率.将“P-t”曲线上指数生长期的Pt,t值代入(1)式中,用计算机进行线性拟合可以得到大肠杆菌的第一指数生长期生长速率常数k1和第二指数生长期生长速率常数k2.表1列举了大肠杆菌在板蓝根提取液作用的k1k2值及最大出峰时间tm和最大产热功率Pm值.1.3.6正丁醇萃取液对大肠杆菌生长代谢“p-t”曲线的影响应用“1.3.1”项下的板蓝根水煎液的正丁醇萃取液采用安瓿法.在无菌条件下,向反应池各20mL安瓿瓶中精确加入5mL培养基,接种大肠杆菌混悬液,接种量为1×106CFU·mL-1,然后分别向8个安瓿瓶中加入正丁醇萃取液,使各安瓿瓶内药液终浓度分别为00.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0mg·mL-1,控温于37℃跟踪记录正丁醇萃取液作用下大肠杆菌生长代谢的“P-t”曲线(如图4).1.3.7板蓝根正丁醇提取液作用大肠杆菌的热动力学特性药物对细菌生长过程的抑制率(I)定义为:式中,k0和kc分别为细菌未受到药物抑制和受到药液浓度为c的药物抑制时的生长速率常数.抑制率I为50%时所对应的药物浓度为半数抑制浓度IC50.IC50越小,表示细菌对药物越敏感,即药物的抑制作用越明显.根据式(1)和(2)计算不同浓度的板蓝根正丁醇提取液作用大肠杆菌的热动力学参数见表2.1.3.8正丁醇萃取液对大肠杆菌mic的mic采用试管稀释法.连续双倍递减法稀释板蓝根正丁醇萃取液,将每个稀释含量的提取物加入到LB培养液中,分别取100µL大肠杆菌细菌(1×106CFU·mL-1)的悬浮培养液接种于试管中,塞好试管,置37℃下培养24h后观察细菌生长情况.肉眼检测菌株没有增殖的最低浓度和菌株明显增殖的最高浓度的试管培养提取物的平均值为正丁醇提取物对大肠杆菌的MIC,正丁醇萃取液作用于大肠杆菌的MIC见表2.2结果与讨论2.1水教育部位和萃取部位的筛选从图1~3的“P-t”曲线可以看出,大肠杆菌在板蓝根各提取方法的水层原液部分和五个萃取部位作用下的生长代谢曲线都呈规律性变化,曲线轮廓相似,而最高峰却发生了前移或后移,表现为tm和Pm的增加或减小.体现在表1的热力学参数为k1,k2,tm和Pm的线性增大或减小.相对于空白对照组,大肠杆菌在水层原液部分作用下k1,k2和Pm均增大,tm减小,表明水层部位促进大肠杆菌的生长.而在各有机溶剂萃取部位和萃后部分作用下,大肠杆菌生长代谢的k1,k2和Pm减小,tm增大,表明大肠杆菌的生长受到抑制.其k1,k2和Pm的大小顺序均为:正丁醇部位<乙酸乙酯部位<氯仿部位<石油醚部位<萃后部分,而tm值的大小顺序为:正丁醇部位>乙酸乙酯部位>氯仿部位>石油醚部位>萃后部分.以上结果表明,五个萃取部位的抑菌作用强弱顺序为:正丁醇部位>乙酸乙酯部位>氯仿部位>石油醚部位>萃后部分.综合比较图1~3的“P-t”曲线,可以发现图1曲线的整体走行趋势最好、规律性最强,最能体现各萃取部位的抑菌特性.表1的数据显示,相同萃取部位相同浓度的药液,水煎液萃取法的各萃取部位作用下大肠杆菌生长代谢的k1,k2和Pm值最小,表明其抑菌作用比另外两种方法提取液的更强.以上结果说明,相同的萃取部位,水煎液萃取法提取的有效成分和活性物质更多、更完全,药效更强、作用更持久,更能反应板蓝根各萃取液的抑菌作用特点,体现和发挥药材的功效.所以,通过对板蓝根的3种传统提取方法(水煎液萃取法、回流法、超声法)水提液的各萃取部位对大肠杆菌的作用效果的考察,初选了水煎液萃取法作为板蓝根药材的提取方法,并筛选正丁醇萃取部位作为板蓝根抑菌活性最强的部位.选择水煎液萃取法作为常用中药材的提取分离方法,更接近临床中药用药原则,易为患者和医院临床所接受,而且方便、快捷,使用仪器简单,经济实用.但是,水煎液在煎煮时温度会很高,可能会破坏药材的有效成分,而且水蒸气挥发比较多,会不会影响药材的应有功效,这些也是以后研究中应该注意的问题.2.2板蓝根正丁醇萃取液对大肠杆菌生长和代谢的影响将大肠杆菌对照组的热功率输出曲线及其在不同含量板蓝根正丁醇提取液作用下的热功率曲线进行比较(见表2),可以看出,随着药物浓度的增加,大肠杆菌的生长速率常数k1和k2均显著降低,最大峰的出峰时间tm逐渐增大,其产热曲线上最大发热功率(Pm)和生长抑制率I随含量的增加而增大.同时图4的“P-t”曲线显示:相对于空白对照组,大肠杆菌的停滞期均延长,曲线的第一生长峰和第二生长峰出峰时间tm均后移,Pm逐渐降低,峰形变得平缓,其整体代谢时间延长.表明板蓝根正丁醇萃取液对大肠杆菌的生长代谢有不同程度的抑制作用,其抑制程度随浓度的增加而增强.IC50为0.64mg·mL-1,MIC为7.6mg·mL-1,也反映了正丁醇萃取液较强的抑菌作用.3板蓝根对中药生物活性的影响近年来有关板蓝根药效成分的研究报道较多,但板蓝根清热解毒的真正物质还不清楚,影响了板蓝根的推广应用.现代药理认为中药清热解毒的药效之一是源于中药中含有抗病原微生物的活性部分或化学成分.本研究以板蓝根作为模型药,采用微量热法研究板蓝根提取液及其不同化学萃取部分对大肠杆菌代谢的影响.结果表明,板蓝根水煎液对大肠杆菌的影响表现为促进生长作用,而水煎液的不同化学萃取部位对大肠杆菌的生长代谢具有不同程度的抑制作用.进一步的实验发现,板蓝根提取物的这种促菌和抑菌作用是基于其中不同活性部分的促菌和抑菌综合作用的结果.该实验也说明了中药多成分、多靶点的药理药效作用特点.因此笔者认为板蓝根清热解毒的药效作用是通过多种途径的方式达到预防和治疗疾病作用的.生物体的整个生长代谢过程都伴随着能量的转移和热变化,具有高灵敏度的微量热仪可以直接、连续地测量生物体生长的产热曲线,即热谱曲线.这些热谱曲线为活细胞等生物模型的生长代谢过程提供了丰富的热力学信息.当细菌在生长代谢过程中受到药物作用时,其代谢热谱曲线会相应地发生改变.因此,通过微量热仪器连续地测量、比较细胞自身和在药物作用下的热谱曲线以获得热力学参数,采用适当的数学模型解析不同药物作用下的细胞生长热谱曲线中蕴含的热力学参数,就可以定性、定量地研究药物对细菌生长代谢的作用,从而客观地表征药物作用于生物体的生物活性.本试验基于微量热仪的性能特点和大肠杆菌在不加药与加不同药液下的生长代谢情况,初选传统中药板蓝根的提取方法和抑菌活性最强部位,为进一