酰基辅酶硫酯酶在脂肪酸代谢中的作用

酰基辅酶硫酯酶在脂肪酸代谢中的作用

1酰基氧化酶a硫酯酶a氨基丙烯酸酶（aco3）广泛出现于原核生物和真核生物中，并存在于真核生物的细胞液、长江三角洲和其他代谢体中。酰基辅酶A硫酯酶按照系统命名法进行了划分,人类中相关的酶用大写字母表示(如ACOT1),大鼠和小白鼠中的酶使用小写字母表示(Acot1)。Acots按照酶的分子量分为两类(类型Ⅰ和类型Ⅱ),类型Ⅰ包含Acotl-Acot6,类型Ⅱ有Acot7-Acot13。两类Acots之间没有明显的序列相似性,但是各个类内部的酰基辅酶A硫酯酶拥有高度的序列相似性。酰基辅酶A硫酯酶能够催化水解酰基辅酶A酯类中的硫酯键来产生辅酶A(CoASH以及相应的非酯化的脂肪酸。Acots催化各种辅酶A酯类的复合物,包括饱和的、不饱和的和支链的脂肪酸,胆汁酸,二羧酸和前列腺素。目前在哺乳动物中检测到的含有酰基辅酶A的组织和器官有大脑、肝脏、肾、心脏、肺和生成固醇类的组织中等。酰基辅酶A硫酯酶1(ACOT1/Acot1,以前也被称作CTE-1,LACH2和ACH2),在小鼠的大脑、心脏、肝脏和睾丸内均有发现,这种细胞质酶主要催化饱和的脂肪族的酰基辅酶A酯类的水解,在鼠科中酶的含量受到高浓度的底物的抑制(小白鼠和大鼠中的长链酰基辅酶A的浓度分别大于20μM和50μM),此外,这种酶的表达还受到空腹和糖尿病的诱导。人类基因组中编码4种I型的酰基辅酶A硫酯酶(ACOT1,ACOT2,ACOT4,ACOT6),这几种酶之间的序列具有高度的保守性,但是每种酶都催化不同的底物。这些酶在C末端包含一个α/β水解酶区域并且包含一个Ser-His-Asp的催化三联体氨基酸,在酶的N端包含一个“β-三明治”区域。到目前为止,I型的酰基辅酶A硫酯酶的晶体结构只有ACOT2的晶体结构得到了解析。本文利用生物信息学的方法得到了ACOT1中存在的有害突变的蛋白序列,利用同源建模的方法得到了ACOT1和ACOT1＿MULT的结构模型,计算并分析了突变对蛋白结构的影响,从非共价键之间的相互作用探究了造成这种结果的原因。本文的研究结果对于阐明序列突变对蛋白结果和功能的影响具有很好的借鉴意义,同时,为基于新形成的活性口袋的药物的筛选工作提供了很好的靶点。2方法2.1生物信息学的相关分析本研究从/Multigenome＿summaries/网站中下载了公共数据Complete＿PublicGenomes54genomes＿B37＿mkvcf.vcf数据进行生物信息＿＿学的相关分析,首先对变异中的数据进行功能筛选,保留发生的非同义突变,影响剪切位点及导致获得终止密码子的SNP位点,然后对保留的SNP数据进行杂合度的筛选,将突变中的发生纯合突变的SNP进行保留,利用ANNOVAR对保留的SNP进行功能注释,并用SIFT,PolyPhen2,LRT,MutationTaster这4款软件对保留的SNP进行氨基酸置换预测,4个软件均预测到了ACOT1中的有害突变位点c.G565A:p.A189T。2.2模型的建立与序列的优化已有文献报道ACOT1和ACOT2的序列同源性为93%,利用同源建模软件Modeller以ACOT2的晶体结构中的A链为模板,构建出了ACOT1的野生型(ACOT1)和突变型(ACOT1＿MULT)模型,由于ACOT2的晶体结构中残基HIS437-GLY441部分缺失,在同源建模的过程中,为了使构建的模型更准确,我们对ACOT1模型中相应的序列进行了优化,并选择其中能量最低的构象作为分子动力学模拟的初始结构。2.3水进行区域能量的大力前处理动力学模拟过程中使用GROMACS软件包作为处理蛋白的主要程序,采用Amber力场中的ff99SB力场用于描述ACOT1中的参数,为了使体系呈电中性,模拟前加入抗衡离子Na+来中和体系,采用含有TIP3P水分子的立方体的水盒子模型,溶质同水盒子边缘之间的最小间距设定为10。组氨酸的离子状态通过使用GROMACS中的程序pdb2gmx程序来决定,组氨酸的质子化状态通过整个体系的氢键网络按照一个简单的几何学标准来决定。为了移除体系中的空间位阻,采用下面的方法进行体系的最小化:先固定体系中的蛋白结构进行5000步的最陡下降法的能量优化,接着进行5000步的共轭梯度法的能量优化,最后在不加限制的情况下重复上面的2个过程。在优化之后,将体系在NVT系宗中从0K加热到300K。模拟前体系进行500ps的构象平衡,模拟过程中采用PME(ParticleMeshEwald)算法来非键结的相互作用,阈值设置为10A,采用SHAKE算法来处理与H原子共价相连的原子,积分步长设置为2fs,每2ps保存一次轨迹坐标。蛋白结构的可视化软件选用VMD。3实验与结果分析3.1n端区域对活性中心稳定活性区域的作用ACOT1具有和ACOT2相同的N端区域和C端区域,其中N端区域包含一个“β-三明治”区域,由7个β折叠组成,其中一个P折叠片由3个短的β折叠组成,另外一个β折叠片由4个长的β折叠组成,虽然N端区域并不是组成活性中心区域的部分,但第4个和第5个β折叠之间的长Loop区域,对于稳定活性区域有重要的作用(如图1)。C末端区域包含α/β水解酶区域,中心部分包含8个β折叠和5个α螺旋,这8个β折叠被5个α螺旋所包裹,并且这8个β折叠是相互平行的,活性中心位于连接α螺旋和β折叠的Loop区域,由一个三联体的氨基酸组成,分别为SER232,ASP326和HIS360。活性中心的上部有一个Loop形成的“盖子”(LEU374-SER380),这个“盖子”区域起到了保护活性中心的作用。氨基酸的突变位点发生在α/β水解酶区域的第4个β折叠的末端氨基酸ALA189位置。3.2结构波动情况在动力学过程中,为了查看体系最终是否达到了稳定的状态,分别计算了2个体系中残基的α碳相对于模拟初始结构的均方根偏差(RootMeanSquareDeviation,RMSD)的波动情况,图2显示了野生型体系和突变体系残基的Cα原子的坐标相对于初始结构的变化情况,从图中可以看出,当模拟时间达到7ns时2个体系慢慢向平衡过渡,当模拟时间达到8ns时,2个体系均已达到了稳定状态。ACOT1和ACOT1＿MULT,2个体系稳定时的RMSD分别为2.3A和2.1。3.3模拟参数设置上的氢键氢键在蛋白质结构的稳定性上起到了重要的作用,由于突变位点发生在一个β折叠的末端,并且突变后的氨基酸苏氨酸(THR189)为极性的亲水性氨基酸,含有极性的羟基基团,为了研究残基突变后对氢键造成的影响,分析了ACOT1和ACOT1＿MULT体系中突变附近的氢键在分子动力学中的氢键的数量以及氢键所占的百分比(如表1所示)。分子动力学过程中,ACOT1体系在ALA189残基附近形成的氢键有PHE164-TYR190,GLU194-ARG140和ASP195-ARG145。ACOT1＿MULT体系在相应的突变位置THR189残基附近形成的氢键有PHE164-TYR190,GLY169-THR189,GLU194-ARG140和ASP195-ARG145。从表中可以发现,氨基酸突变后,THR189与相邻的160Loop区域的氨基酸GLY169形成了新的氢键,模拟过程中氢键所占的百分比为74%。通过进一步的分析发现,由于模拟的初始阶段残基之间的位置取向的原因使得在模拟的前1ns的时间内并没有氢键的形成,但在后面的模拟过程中氢键所占的比例达到了80%～95%之间,说明了THR189-GLY169在模拟过程中形成了稳定的氢键。由于ARG140位于α/β水解酶区域的第一个β折叠片末端的位置,GLU194和ARG140残基位于突变位置所在的Loop区上。ARG145残基位于第2个β折叠片初始的位置,突变前后GLU194-ARG140之间氢键所占比率的上升和ASP195-ARG145之间氢键所占比率的下降更有利于突变位置附近的β折叠和160Loop区域向外部的极性溶剂的方向发生扭转。3.4模型结构距离分析疏水相互作用也是稳定蛋白质结构的又一重要的因素,在模拟过程中,本研究分析了位于活性中心上面的“盖子”区域(对应的残基为LEU374-SER380)与相邻160Loop(α/β水解区域的第3个β折叠的末端区域)区域之间的疏水相互作用的变化。为了便于研究疏水相互作用,分别从2个Loop区域中选取了2个具有代表性的残基的中心作为计算相互之间距离的端点,“盖子”区域选取的残基为ALA376和LEU377,相邻的Loop区选取的代表性的残基为GLY167和GLY168。计算之后的结果如图3所示。从图中可以发现ACOT1体系中,2个Loop区域之间的距离在模拟初始阶段距离在5A左右,随着模拟时间的延长,2个Loop区域之间的距离逐渐缩小,当模拟达到稳定状态时,它们之间的距离维持在3A左右,表明它们之间已经靠疏水相互作用达到了结构的稳定状态。在ACOT1＿MULT体系中,从模拟开始时2个Loop当模拟达到稳定状态时,2个Loop之间的距离已经超过了7A,说明它们之间的相对位置发生了很大的变化,由此可得出它们之间已经不存在疏水的相互作用。3.5外在结构的结构变化为了更加直观的观察分子动力学过程中2个体系的变化情况,研究中分别提取出了2个体系在分子动力学模拟中最后2ns内的稳定的构象进行分析,并将提取出的稳定时的构象与模拟初始时的构象进行对比,观察活性中心以及活性中心附近的Loop区域以及残基的变化情况,具体的对比后的结果如下图(图4)所示,从图中可以看出,在ACOT1体系中(图4(a)和图4(b)),突变残基ALA189THR附近的Loop区域以及活性中心附近的“盖子”区域(图4(a)中画线部分)相互靠近,使得2个Loop区域之间的距离逐渐缩小,起到了很好的保护内部的活性中心的作用。活性中心内部的三联体氨基酸(SER232,ASP326和HIS360)在动力学过程中相对于初始结构并没有发生太大的变化。为了更加形象的展示活性中心附近的“盖子”区域的变化,用表面化的方式展示了整个蛋白的结构(图4(b)),从图中可以发现,活性中心附近的2个Loop区域已经稳定的结合在了一起,形成了一个类似于“桥”状的结构,活性中心的三联体氨基酸位于“桥”的下面,这个结构的形成更有利于在活性中心周围形成一个疏水性“盖子”,使得配体或抑制剂分子稳定的结合在活性中心的内部。在ACOT1＿MULT体系中,由于残基ALA189突变成了带有极性的羟基基团的THR,从上面氢键的分析过程中可以发现,突变位点与相邻的Loop区域内的氨基酸形成了新的氢键,使得此Loop区域朝着突变位点所在的第4个β折叠的末端Loop区域拉伸(图4(c)中右下方的画线部分),对应的活性口袋上面的“盖子”区域也在分子动力学过程中发生了很大的偏移(图4(c)中右上方的画线部分),从图4(c)中可以发现,分子动力学过程中活性中心的催化三联体氨基酸的相对位置并没有发生明显的变化。将突变后的ACOT1＿MULT体系分子动力学的稳定构象通过表面化的方式显示后的结果(图4(d))发现,活性中心上方的“盖子”区域在动力学过程中丢失,蛋白的活性中心暴露在亲水性的环境中。由此可以发现,突变后新的氢键的形成不仅影响到了与其相邻的Loop区域的变化,同时也间接的影响到了活性中心上面的“盖子”区域的变化。4gly139突变本研究用分子动力学模拟的方法研究了氨基酸突变对蛋白结构造成的影响。通过氢键及疏水作用的分析发现氨基酸突变后蛋白活性中心的“盖子”区域丢失,致使蛋白的活性中心暴露在亲水的环境中,改变了活性中心周围的结构,同时也影响了活性中心和