蛋白质分离和鉴定

蛋白质别离和鉴定1编辑ppt2编辑ppt一.概述蛋白质组及蛋白质组学概念的提出蛋白质组学形成的历史蛋白质组研究的主要手段3编辑ppt人类基因组方案的完成3-4万个基因，30亿对碱基〔解码生命〕基因组是唯一的，但蛋白表达是变化的〔解码生命〕后基因组—蛋白质组的研究是21世纪生命科学的主要任务〔WilkinsMRetal1997)1994年Williams提出测定有机体的基因组所表达的全部蛋白1995年Wilkins正式提出Proteome一词由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，而研究蛋白质组功能为蛋白质组学〔Proteomics〕1、蛋白质组及蛋白质组概念的提出4编辑ppt

基因组转录组蛋白组ThestudyofproteinsexpressedbygenomesCompletionofthesequencingofthe1stdraftofhumangenomeindicatesthereareapproximately250,000proteinsinthehumangenomeOnly2-5%ofproteinsinhumangenomehavebeenidentified5编辑ppt6编辑ppt7编辑pptExpressionproteomics(表达蛋白组学)ThestudyofglobalchangesinproteinexpressionProteomicsCell-mapproteomics〔细胞图谱蛋白组学〕Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes8编辑ppt2、蛋白质组学形成的历史1860FriedrichMiescheridentifiedacidandbasicproteincomponentsincellnucleiwhichwasmistakenlybelievedtocarrythegeneticmaterial

1970KenrickandMargolisIsoelectricfocusingandgradientgelelectrophoresis:atwo-dimensionaltechnique

1972BernsteinetalTheProteinDataBankwithacollectionoftenX-raycrystallographicproteinstructures

1975O'FarrellThemodernformoftwo-dimensionalelectrophoresisofproteinsbyhighresolutionseparation9编辑ppt1995WilkinsDefinitionoftheproteome

1997WilkinsetalPublicationofthefirstbookonproteomics

1999IanHumphery-Smith.ThefirstChairinProteomicscreatedattheUniversiteitUtrecht,TheNetherlands.Occupant

2000MarchPublicationofthemostcompleteproteomeofawholeorganism,thebacteriumMycoplasma

genitalium

2001Sequencingofthehumangenomecompleted.2、蛋白质组学形成的历史10编辑ppt11编辑ppt12编辑ppt13编辑ppt14编辑ppt15编辑ppt蛋白组研究的三个主要步骤：

Separationofindividualproteinsby2-Dpolyacrylamidegelelectrophoresis(2-DPAGE)

IdentificationbymassspectrometryorN-terminalsequencingofindividualproteinsrecoveredfromthegel

Storage,manipulation,andcomparisonofthedatausingbioinformatics16编辑ppt17编辑ppt3、蛋白质组研究的主要手段双相电泳技术〔twodimensionalelectrophoresisgel2D〕“双向〞高效柱析法分子筛柱层析反向柱层析质谱分析(MS)辅助激光解析/离子化(matrix-assistedlaserdisorption/ionization)电喷雾离子化〔electrosprayionizationESI〕生物信息18编辑ppt二.蛋白质的别离和鉴定

1:蛋白质的别离19编辑ppt20编辑ppt21编辑ppt一维凝胶电泳二维凝胶电泳蛋白芯片22编辑ppt23编辑ppt双向电泳技术1975年，O`Farrelletal创造了双向电泳技术。能检测到3000~4000种总蛋白，最大可到达一万种一个细胞有5000~6000种不同蛋白，人体有250种细胞，每个细胞表达300~400种自身特有蛋白24编辑pptSamplePrep2-DGELSMASSSPECMALDI-TOFSpotCutterProteinDigestMALDISpottingSampleSWISS-PROT/TrEMBLESIMS/MSImagingD/BASEPepSeq蛋白组学研究过程SWISSPROT/TrEMBLMicroMassABIBruker样品样品制备2维电泳纯化和点样质谱测序数据库分析

成像25编辑pptProteinextract1LabelwithCy™2ImagegelImageanalysis:Overlayimages

AnalysisofdifferenceImageanalysis:Dataquantitation

MixlabeledextractsProteinextract2LabelwithCy3Proteinextract3LabelwithCy5Cy2Cy3Cy526编辑pptPH2-11MW10k-150k银染灵敏度4ng同位素灵敏度20ppm27编辑pptCoomassieBrilliantBlue&SilverStain

28编辑ppt荧光染色29编辑ppt30编辑ppt激光捕获显微切割技术〔LaserCaptureMicrodissection〕1.Preparetissue2.Locatecells3.Placecap4.Pulselaser5.Removecap6.Extractmolecules31编辑pptBeforeLCMAfterLCMCapturedCells32编辑pptInvestigator™蛋白组学研究系统高度自动化率效率蛋白鉴定特定蛋白别离操作灵活方便高通量多功能、自动化的大规模蛋白组学系统33编辑ppt二.蛋白质的别离和鉴定

2:蛋白质的鉴定34编辑ppt质谱分析(MS)分类：辅助激光解析/离子化&电喷雾离子化原理：样本分子离子化后,根据不同离子间质荷比(m/e)差异,别离样本,确定分子量介质辅助的激光解吸/离子化35编辑ppt质谱技术MALDI;matrix-assistedlaserdesorption/ionization,(介质辅助的激光解吸/离子化

)ESI;electrosprayionization(电喷雾离子化

)多肽分析36编辑ppt37编辑ppt多肽氨基酸分析串联质谱〔Tandem-MS〕,第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂，形成一系列离子，即N端碎片离子系列〔B系列〕和C端碎片离子系列〔Y系列〕，将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。“proteinladdersequencing〞的方法，通过对Edman降解法的修改，产生一系列截去N端残基的肽段，用MALDI-MS测得这些肽段的质量，从而推测N端序列。38编辑ppt39编辑ppt40编辑ppt41编辑ppt42编辑ppt局限性，譬如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。

43编辑ppt44编辑ppt45编辑pptGenomicSolutions’完整的蛋白组学研究系统Produce2-DGelsImage2-DGelsExciseSpotFromGelProcessProteinMS&AnalyzeSpotonMALDIStageAnalyze2-DGelsGeneCompanyLimited

基因有限公司46编辑ppt47编辑ppt48编辑ppt定量分析49编辑ppt图3.不同发育时期的大鼠胰腺总蛋白二维电泳图象。第一维电泳采用固相PH梯度凝胶胶条（PH4-7，线性），第二维电泳采用均一的12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶。各时期蛋白上样量均为50μg，银染。加框区域内蛋白点各组间有显著差异。(a:E15.5；b:E18.5；c:P0；d:成年)不同发育时期大鼠胰腺蛋白质组差异的分析

50编辑pptSpotIDSwissprotIDTheoreticalPi/MWObservedPi/MWSequencecoverage(%)Proteinname1P027735.77/68.385.39/7716Alphafetoprotein(AFP)2P027735.77/68.385.46/7627Alphafetoprotein(AFP)3P027735.77/68.385.54/7626Alphafetoprotein(AFP)4P027735.77/68.385.61/7625Alphafetoprotein(AFP)5P027735.77/68.385.69/7431Alphafetoprotein(AFP)6P027735.77/68.385.61/7429Alphafetoprotein(AFP)7P078825.36/65.325.29/7021sterolesterase8P078825.36/65.325.35/7033sterolesterase9P078825.36/65.325.41/7027sterolesterase10P047854.82/56.954.84/5840Proteindisulfideisomerase,pancreatic11P047854.82/56.954.76/5835Proteindisulfideisomerase,pancreatic12P543165.79/52.385.88/5769Pancreaticlipaserelatedprotein1precuror13P027735.77/68.385.75/4440Alphafetoprotein(AFP)14P046914.79/505.55/3741tubulin,beta15P166178.02/44.915.9/4031phosphoglyceratekinase116P052184.78/49.675.38/3755Tubulinbeta517P543165.79/52.385.68/4257Pancreaticlipaserelatedprotein1precursor18P543165.79/52.385.64/3954Pancreaticlipaserelatedprotein1precursor19P543165.79/52.385.84/3963Pancreaticlipaserelatedprotein1precursor20P073384.9/28.464.89/2848ChymotrypsinogenB21P073384.9/28.465.02/2833ChymotrypsinogenB22P073384.9/28.465.13/2827ChymotrypsinogenB23P073384.9/28.465.25/2831ChymotrypsinogenB24Q8CFI85.27/63.884.76/3114ProteinFLN2925P328214.93/26.904.91/2549TrypsinV-Aprecursor26P677795.57/29.85.62/3043prohibitin27P027735.77/68.385.71/2925Alphafetoprotein(AFP)28P046395.52/305.7/2630apolipoproteinA-I29O887676.32/19.96.16/2378Parkinsondiseaseprotein7homolog30Q9Z0V56.18/31.216.05/2546Peroxiredoxin431P357045.34/21.85.3/2135peroxiredoxin232P543165.79/52.385.30/2222Pancreaticlipaserelatedprotein1precursor不同发育时期的大鼠胰腺蛋白2D-E图谱差异蛋白点的质谱分析结果51编辑ppt不同发育时期大鼠胰腺蛋白质组差异的分析

图5.不同发育时期的大鼠胰腺各差异蛋白质的总相对丰度。各时期蛋白质的相对丰度用各时期２Ｄ图中各相应蛋白质点的ＯＤ值与其面积值的乘积之和表示。52编辑pptAFP在不同发育时期大鼠胰腺中的表达图6：不同发育时期大鼠胰腺总蛋白AFP免疫印迹结果。各时期蛋白上样量均为40μg．53编辑pptAFP在不同发育时期大鼠胰腺中的趋势表达图7：不同发育时期大鼠胰腺总蛋白AFP免疫印迹光密度积分相对值。与Ｅ18.5相比，＊Ｐ<０.０１。54编辑pptAFP在不同发育时期大鼠胰腺中的细胞定位55编辑pptAFP在不同发育时期大鼠胰腺中的细胞定位56编辑pptAFP特异表达于间充质细胞57编辑ppt免疫杂交HCG-HCG+转醛酶双向电泳免疫杂交58编辑ppt质谱技术的应用范围59编辑ppt质谱技术的应用范围60编辑ppt3：生物信息学生物信息学在基因组学/蛋白质组学的研究中起重要作用。包括数据的输入、储存、加工、索取以及数据库之间的联系。数据处理需要设计各种特殊软件，对数据进行综合分析，不同的数据库之间要有高效自动的应答。数据库要有严密管理。蛋白质组比基因组具有更大的复杂性。基因组学/蛋白质组学的开展促使生物信息学迅速开展。例如用生物信息学对质谱得到的肽指纹图谱〔peptide-massfingerprinting〕分析出了一个新的在进化过程中保守的模序〔motif〕，它对蛋白质的结构和功能具有重要意义。用分子建模〔molecularmodelling〕61编辑ppt62编辑ppt存在问题质谱技术双向电泳63编辑ppt质谱技术的应用64编辑ppt蛋白芯片技术65编辑ppt三.

二维胶数据库66编辑ppt四.蛋白质组研究的现状和前景

1:原核及简单真核生物的蛋白质组研究

蛋白质组研究目前还主要集中于原核生物及一些简单的真核生物，尤其是一些基因组序列被完全搞清或大局部的生物，如支原体、菌、酵母等。

2:大肠杆菌的蛋白质组研究

大肠杆菌全部4000多个基因的DNA序列已被测定，并由此建立了蛋白质-基因联合数据库

a.所有编码基因的产物在双向图谱上的位置

b.各种蛋白质的丰度

c.不同条件下各种蛋白质表达水平及合成速率的变化

d.各种蛋白质在细胞内的定位

e.某些蛋白质翻译后修饰的方式和水平67编辑ppt大肠杆菌的联合数据库已更新到第六版，包括1,600个蛋白质斑点的数据，其中大约400个已与大约350个基因相对应。对于这些蛋白质，这个数据库可以提供基因名称、蛋白质名称、E.C.编号、功能范畴、Swiss-Prot数据库编号、Genbank序列号、基因图谱的位置、染色体上的转录方向及一些生理信息〔如在不同生长条件下该蛋白质在细胞内的丰度〕。3:致病微生物的蛋白质组研究蛋白质组的一个重要引用是在说明新抗生素作用机理上。

4:酿酒酵母的蛋白质组研究〔Saccharomycescerevisiae〕丹麦的一项研究,分别作出野生型和将基因系统缺失的缺陷型酵母的蛋白质图谱。说明，缺失单一基因将导致不只是缺乏此基因编码蛋白质，而是导致其它一系列蛋白质量的改变。单一基因缺失的结果总是引起蛋白质组全局性的变化。大约20%的酵母基因缺失是致死性的，另外80%那么不然，是机体能通过调节蛋白表达来对抗这种内源性的变化。基因缺失可能会