海桐煤污病病原菌的分离鉴定及其抑菌活性

海桐煤污病病原菌的分离鉴定及其抑菌活性

煤污病，又称煤烟病和叶霉菌，是一种非常常见的植物疾病。煤污病分布广泛,尤其在花木上发生普遍,如在冬青、八角金盘、石榴、牡丹、柑橘、米兰、海桐等观赏植物上均有发生。但由于其对寄主植物并不发生直接的寄生关系,因此未引起人们的足够重视。随着时间的推移和环境条件的改变,煤污病在许多情况下已上升为植物的主要病害种类。尤其是在园林植物中,煤污病的发生给其带来更多的危害,比如间接影响植物生长,减低观赏价值,破坏美感,引起过敏甚至引起死亡等。而海桐Pittosporumtobira(Thunb.)Ait煤污病主要发生于叶片及小枝条上。发病初期,叶片表面出现暗褐色霉斑,以后逐渐扩大,形成黑色烟煤状霉层(干燥时菌丝层在海桐叶表面象一层黑纸,很容易揭下来);受害的叶片背面常伴有大量的蚧壳虫为害。下部枝叶的病情尤其严重。海桐煤污病不但阻碍海桐的光合作用,减弱其生长势,致使植株颜色暗淡,枝叶没有光泽,严重影响其观赏功能,甚至可导致植株枝叶及果实枯萎而死亡。目前对煤污病的研究多侧重于病原菌的分离和症状的描述,且现有的研究对象多限于具有较高经济价值的植物(如苹果、梨树、柑橘等),而对煤污病的防治方法尤其是针对园林绿化植物煤污病的研究尚少。作为常绿乔木或灌木的海桐,是我国传统的园林绿化观赏树种,除用作观赏(其叶、花、果都有观赏价值)外,还是一种对二氧化硫有很强抗性的环保植物,在城市的园林绿化中很受欢迎。但由于其栽种地域广泛,栽植密度大,且多种植于人口稠密的城市园林中,所以很容易遭受煤污病的危害,使其观赏价值和绿化作用受到不良影响。因此,有必要积极研究海桐煤污病,以便有效地进行防治,使海桐的观赏价值和绿化功能继续得到有效利用。本研究除对海桐煤污病的病原菌进行分离外,还选择2种常用的杀菌剂,分别选用不同浓度进行处理,并初步测定其对海桐煤污病病原菌的室内毒力,以期为海桐煤污病的室外药剂防治提供理论依据。1材料和方法1.1样本的分离采集症状明显、污染少的海桐煤污病病叶,用灭菌牛皮纸袋装好备用。1.2培养基马丁氏培养基,用于病原菌分离。马铃薯培养基(PDA培养基),用于病原菌菌悬液的制备和杀菌剂室内毒力的测定。1.3分离方法1.3.1分离和纯化病原菌,分离、培养、利用在采集的新鲜样品中选取带有病原菌且表面杂质少的叶片,将病叶剪成小块(约5mm见方)作为分离材料。先在70%酒精中浸3～5s,然后放入0.1%的升汞水中,表面消毒约20s,马上用灭菌水清洗3次。待分离的病组织经表面消毒后,将镊子在火焰上先消毒,后取上述病组织移入马丁氏培养基平板上,每皿放4块。重复做多个样品。最后放置在25℃的培养箱中倒置培养;每天检查病原菌生长情况,待长出病原菌菌落后移至培养基平板上进行纯化。应多纯化几次直至获得纯菌株,移至试管斜面培养,待培养好后保存于冰箱中。1.3.2试样的制备选择新发病的病叶直接挑取菌体进行分离。将切好的病叶置于体视镜下,将体视镜调至低倍(20×),在叶片上的菌丝体中,寻找干净未污染的部位,逐渐调高放大倍数(60×),选好合适部位。将挑针在酒精灯上高温灭菌,然后用针尖在培养基表面划线,使针尖冷却并黏附少量培养基以利于挑取时黏着菌体。在体视镜下,轻轻将菌体片段剥离叶片,黏着在针尖上,缓缓转移到试管中的斜面培养基上。每个样品重复多次。最后放置在25℃的培养箱中倒置培养。1.4悬浮液的制备1.4.1病原体的扩张选择1株菌株(GN1)接种到由250mL三角瓶倾成的培养基大斜面上进行扩繁,于25℃培养箱中倒置培养。1.4.2悬浮液的制备在扩繁好病原菌的三角瓶中加入10mL无菌水,用接种铲轻轻刮下琼脂斜面上的病原菌,并不断摇荡三角瓶让其混合均匀备用。1.5消毒准备1.5.1基-2-硫脲基苯甲基硫菌灵70%甲基托布津,其化学式为:1,2-双(3-甲氧羰基-2-硫脲基)苯甲基硫菌灵;75%百菌清,其化学式为:2,4,5,6-四氯-1,3-二氰苯。两者均为广谱性杀菌剂,能对真菌的生长及其孢子的萌发产生抑制作用。1.5.2u3000酸、酸、m甲基托布津和百菌清均测定6个浓度:0.00500g·mL-1、0.00333g·mL-1、0.00250g·mL-1、0.00200g·mL-1、0.00165g·mL-1、0.00125g·mL-1,即200、300、400、500、600和800倍液。用稀释法配制,即先配制浓度高的溶液,再用无菌水稀释成低浓度的溶液。1.5.3角瓶和三角瓶制备法高温加热消毒,即将配制好的杀菌剂装入三角瓶中,先在瓶壁上划下液面高度,然后将三角瓶放在电炉上加热直至煮沸,持续5min,用无菌水补足至煮前刻度线。倒入灭菌棕色试剂瓶中冷却待用。1.6抑菌圈测定采用纸碟法,即用1mL移液管吸取菌悬液,吸取前将菌悬液吹匀。在每个PDA培养基平板上接种0.1mL菌悬液,用玻璃刮将菌悬浮液刮匀。把事先剪好的直径为17mm并已经消毒的小圆纸碟,放在供试的杀菌剂中浸透,然后用灭菌镊子夹出置于琼脂培养基表面,位置居中,每个培养皿中放1个纸碟。2种杀菌剂各测定6个浓度,每个浓度各设3～5个重复;并用0.2%升汞水和无菌水浸透的纸碟作对照,升汞水与无菌水各3次重复。将培养皿放在25℃培养箱中倒置培养,3d后,在培养皿背后标出抑菌圈的范围,即可测定抑菌圈直径。以抑菌圈直径的大小代表杀菌剂毒力的大小。1.7国外对抗菌环直径的测量1.7.1测定抗菌圈直径在培养皿背后标出抑菌圈的范围,量取抑菌圈的最长直径和最短直径,取其平均值作为该抑菌圈的直径。1.7.2药剂浓度试验用2种杀菌剂各浓度多个重复的平均值直接进行比较的方法,分析2种杀菌剂的室内毒力及与对照的差异性;并根据试验数据作出2种杀菌剂的药剂浓度—直径曲线图;用单因素方差分析法分析2种杀菌剂不同浓度之间对抑菌圈直径大小的影响是否有显著差异。2结果与分析2.1药物品种鉴定经2种分离方法分离,均获得海桐煤污病病原菌若干株。初步鉴定均为子囊菌亚门座囊菌目煤炱科煤炱属Capnodiumsp.的种类。分离过程中还发现此病原菌存在其它伴生菌。2.2结果表明，测定了消毒室内毒的肥力2.2.1种药物对抑菌圈的生长抑制作用为测定2种供试杀菌剂的抑菌效果,选择6个浓度进行室内毒力的测定,并设无菌水和升汞2个对照,结果见表1。由表1可看出,甲基托布津、百菌清2个处理和升汞、无菌水2个对照之间的抑菌圈直径大小有显著差异,即甲基托布津、百菌清、升汞3种药剂对病原菌都有明显的抑制作用;而用无菌水处理的纸碟周围却无抑菌圈出现,连纸碟上也长满病原菌,表明无菌水对此病原菌生长无任何抑制作用。在甲基托布津、百菌清、升汞3种药剂之间,升汞处理的抑菌圈明显小于甲基托布津和百菌清处理的抑菌圈,除百菌清0.00125g·mL-1(800倍液)的抑菌圈(2.80cm)稍小于升汞的抑菌圈(2.83cm)外,其余处理的抑菌圈均远大于升汞的抑菌圈。由此可见,甲基托布津和百菌清2种杀菌剂对病原菌的抑制效果明显。由表1还可看出,2种不同药剂的抑菌圈直径大小有明显差异,说明其对病原菌生长的抑制程度不同。在测定的6个浓度中,除百菌清0.00333g·mL-1(300倍液)的抑菌圈(4.40cm)稍大于甲基托布津0.00333g·mL-1(300倍液)的抑菌圈(4.33cm)以外,其余处理的抑菌圈均是甲基托布津明显大于百菌清,分别大0.92cm、1.85cm、1.44cm、1.51cm和1.00cm。所以从直观上可以看出,甲基托布津的室内毒力明显强于同浓度的百菌清。2.2.2甲基托布津对抑菌圈直径的影响所测结果见表2。由表2可见,浓度为0.00250g·mL-1的抑菌圈最大(5.20cm),而浓度为0.00125g·mL-1的抑菌圈最小(3.80cm),相差明显(相差1.40cm)。为了解不同浓度的甲基托布津之间的抑菌圈大小有无显著差异,对表2的数据进行方差分析,结果见表3。由表3可见,甲基托布津的不同浓度对抑菌圈的直径大小有显著影响,说明浓度不同的甲基托布津有显著的毒力。但各浓度之间的差异还需作多重比较,结果见表4。由表4可清楚看出不同浓度之间抑菌圈大小的差异性。200倍液、300倍液及800倍液的抑菌圈大小均和400倍液的抑菌圈大小有显著差异;而200倍液、300倍液及800倍液的抑菌圈大小之间无显著差异;400倍液、500倍液及600倍液的抑菌圈大小之间也无显著差异。由于400倍液的抑菌圈直径(5.20cm)明显大于其它浓度,再考虑到400倍液和500倍液及600倍液的抑菌圈大小之间无显著差异,因此可以得出这样的结论,即400倍液、500倍液和600倍液是表现较强的3个浓度,而其中400倍液则是室内毒力表现最强的浓度。2.2.3百菌清抑菌圈大小的差异百菌清不同浓度抑菌圈直径测定结果如表5所示。由表5可见,百菌清浓度为0.00333g·mL-1的抑菌圈最大(4.40cm),而浓度为0.00125g·mL-1的抑菌圈最小(2.80cm),相差明显(相差1.60cm)。为了解不同浓度百菌清之间的抑菌圈大小有无显著差异,对表5的数据进行方差分析,结果见表6。由表6可见,百菌清不同浓度的抑菌圈直径大小之间有极显著差异,说明浓度不同的百菌清有极显著不同的毒力。经对百菌清不同浓度的抑菌圈直径作多重比较,结果表明,只有300倍液百菌清的抑菌圈直径和其余5个浓度之间有明显差异,而5个浓度两两之间则均无显著差异。由于300倍液的抑菌圈直径(4.40cm)明显大于其它浓度,可以说浓度为300倍液的百菌清是室内毒力表现最强的浓度。2.2.4甲基托布津与百菌清的关联试验结果为了直观地反映2种杀菌剂不同浓度与抑菌圈直径之间的关系及其变化趋势,将表1的结果绘制成2种杀菌剂的浓度—直径曲线图(见图1)。在图1所示的曲线中(系列1),甲基托布津室内毒力的变化曲线显示抑菌力先随着浓度的升高而逐渐升高,至0.0025g·mL-1(400倍液)时达到最高点,然后逐渐下降。这说明甲基托布津的抑菌力在浓度低于0.0025g·mL-1之前是由其浓度来影响的,而高于0.0025g·mL-1之后则是由其溶解度来影响的,浓度为0.0025g·mL-1时,溶液达到饱和状态。而从百菌清室内毒力的变化曲线(系列2)来看,抑菌力先逐渐升高,至0.0033g·mL-1(300倍液)时达到最高点,然后逐渐降低,说明百菌清的浓度为0.0033g·mL-1时,溶液达到饱和状态。由此可见,杀菌剂的毒力除受浓度影响外,还受其在介质中的溶解度的影响。在本试验条件下,甲基托布津浓度为0.0025g·mL-1(400倍液)时,溶解度最高,抑菌力最强;而百菌清浓度为0.0033g·mL-1(300倍液)时,溶解度最高,抑菌力最强。这与方差分析的结果一致。3讨论3.1组织分离方法在海桐煤污病的病原菌分离过程中发现,用常规的组织分离法分离后菌种不易纯化;加上煤污病病原菌主要生长在叶片的表面,消毒时间不易掌握,所以常规的组织分离法对分离煤炱菌的效果不是太好。而从病组织上直接挑取菌体分离的方法,则可以避免在分离过程中受到其它真菌和细菌的干扰和污染,分离成功率较高。3.2海桐煤污病的防治对策本试验证明,甲基托布津及百菌清对海桐煤污病的病原菌均有毒杀能力。其中尤以甲基托布津的抑菌能力更强。不同浓度的甲基托布津以400倍液、500倍液和600倍液的室内毒力表现较强,而以400倍液浓度的抑菌效果最好(抑菌圈直径平均为5.20cm);不同浓度的百菌清则以300倍液的室内毒力最强(抑菌圈直径平均为4.40cm)。因此,在海桐煤污病的化学防治实践中可参考选择相应浓度的甲基托布津或百菌清药剂。煤污病病原菌的菌丝、分生孢子和子囊孢子都能越冬,成为下一年初侵染的来源。而叶、枝的表面灰尘、蚜虫蜜露、介壳虫分泌物或植物渗出物等分生孢子和子囊孢子均可在上面生长发育。菌丝和分生孢子借气流、昆虫传播进行重复侵染。病害的发生与环境的关系密切。首先,当上述害虫为害严重时,煤污病的发生也相应严重。其次,湿度越大,发病越重。由于海桐多用于园林绿化,栽植密度大;病害每年3月上旬至6月下旬,9月下旬至11月下旬为2次发病;因此,防治海桐煤污病不是件容易的事,应在科学管理的基础上进行综合防治。如在发病初期可用波尔多液进行防护;发病盛期可使用800～1200倍液的甲基托布津或600倍液的百菌清来防治(由于毒力测定中菌悬液的加入使杀菌剂的浓度稀释约1倍,所以实际使用时的浓度也相应稀释1倍)。这与其它树种煤污病的化学防治的研究结果基本一致。3.32杀菌对病原菌生长的影响从测量抑菌圈直径的日期起至抑菌圈内长出病菌为止,两数相减即为杀菌剂的持效期。在持效期内,杀菌剂对病原菌有抑制作用;超过这一时期,杀菌剂则对病原菌生长失去影响。供试的2种杀菌剂中,甲基托布津的持效期可达10d,百菌清的持效期则为7～10d。海桐煤污病始发期于每年早春,即3月中旬新生叶片上开始发病,因而化学防治应在新叶发病初期用药,可在药效期内最大限度地控制病原菌为害(即每隔10d或7～10d用药1次,连续多次,直至叶片发育完成),以提高海桐的观赏价值。