L-色氨酸生产菌的筛选

L-色氨酸生产菌的诱变筛选及鉴定

作者姓名

李军

专业生物工程

指导教师姓名

陈静

专业技术职务

副教授

主要内容本课题的目的和意义国内外的现状和展望实验材料和方法结果与分析讨论本课题的目的和意义本课题利用细菌生物合成L-色氨酸代谢途径的特点，设计了分离筛选产色氨酸菌株的细菌选择性培养基，并通过初筛和复筛，从土壤中筛选到几株产色氨酸的野生菌株，并通过诱变，进一步提高产色氨酸水平，有望达到工业化生产的要求.国内外的现状和展望国内主要是高价格限制了色氨酸的生产，世界主要生产色氨酸的国家是日本。随着科学技术的不断进步，世界色氨酸工业将会有长足的发展，L-色氨酸的市场前景令人乐观。实验材料和方法1.1实验材料与试剂土样(按土样采集标准方法采集)；吲哚；蛋白胨；牛肉膏；(NH4)2SO4；KH2PO4；MgSO4·7H2O；CaCO3；蒸馏水；琼脂；NaCl；制霉菌素；玉米浆；NaNO2；葡萄糖；色氨酸标准溶液。

1.2实验设备

高温灭菌锅北京永光明医疗仪器厂

ALC110.4电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司

DK-S24型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司台式离心机上海安亭科学仪器厂

SW-CJ-1G型净化工作台苏州净化设备有限公司

SK-1快速混匀器金坛市富华仪器有限公司

SHP-2500型低温生化培养箱上海精宏实验设备有限公司往复式摇床(振幅10.5cm)天津轻院机电厂制造

OLYMPUS生物显微镜日本OLYMPUS会社三角瓶（300mL）若干培养皿若干试管（15×15018×180）若干

pH试纸、玻璃棒、移液枪、枪尖、离心管、载玻片、盖玻片各若干。

1.3实验方法1.3.1培养基的制备A.细菌选择性培养基(%)

葡萄糖1.0，牛肉膏1.0，酵母膏0.5，蛋白胨

1.0，NaCl0.3，吲哚0.1，制霉菌素50μg/L，琼脂粉1.6，用NaOH和HCl调pH至7.2，115℃下灭菌30分钟。B.种子和平板培养基（%）葡萄糖4.0，(NH4)2SO40.4，酵母膏0.5，玉米浆3.0，吲哚0.1，K2HPO40.1，KH2PO40.1，

MgSO4·7H2O0.025，FeSO4·7H2O10mg/L，

MnSO410mg/L，用NaOH

和HCl调pH至7.2，

115℃下灭菌30分钟。

C.斜面培养基：牛肉膏蛋白胨细菌培养基。D.复筛发酵培养基（%） 蔗糖10.0，玉米浆2.0，吲哚0.1，K2HPO40.05，KH2PO40.05，MgSO40.025，FeSO410mg/L，MnSO410mg/L，CaCO32.0（分别灭菌），用NaOH

和HCl调pH至7.2，115℃下灭菌30分钟。

1.3.2土样采集

参照土样采集标准方法，从麦田，树林，草丛，臭水沟等处采集土样和水样。

1.3.3富集培养取1g土样加入盛有10mL无菌水的试管中，震荡摇匀后取5mL悬浮液加入盛有25mL选择性培养基的三角瓶中，30℃、150r/min培养3-5天后。

1.3.4菌株的筛选

1.3.4.1菌株的初筛A.平板分离：将经富集培养的菌液用无菌水适当稀释，取一定量涂布分离平板。30℃培养2-3天，将单菌落挑至斜面上保藏。B.菌株的初筛：将菌株发酵培养后取发酵液，离心，上清液用对二甲胺基苯甲醛法显色，以目测法选出呈深蓝色者，作为产色氨酸菌株，留作复筛用。1.3.4.2菌株的复筛将初筛获得的产色氨酸菌株再进行发酵培养，发酵液离心后取上清液用对二甲胺基苯甲醛法显色后，用

分光光度计于测定吸光度，并与根据色氨酸标准曲线计算出色氨酸的含量。

1.3.5菌株的诱变紫外诱变的意义：通过对复筛菌株的诱变，选出产色氨酸量高且遗传性状稳定的菌株。

1.3.6发酵条件优化

1.3.6.1pH的影响将初始pH值设定为6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，研究pH值对L-色氨酸产量的影响。

1.3.6.2温度的影响将发酵温度分别控制为28℃、30℃、32℃、34℃和36℃，研究温度对L-色氨酸产量的影响。

1.3.6.3装液量的影响将装液量分别控制为15mL、20mL、25mL、30mL和40mL，研究装液量对L-色氨酸产量的影响。

1.3.7菌株的鉴定根据《伯杰氏细菌分类手册》(第八版)，镜检分类鉴定所筛菌株。

1.3.8菌株的保藏在无菌条件下，从相应斜面上挑取一大环菌体（因为在冻存过程中会有部分菌体死亡）接入盛有1mL冻存液的1.5mL离心管中，做好标记，然后放入-20℃冰箱中冻存。结果与分析2.1色氨酸产生菌的筛选2.1.1色氨酸菌株的初筛采用摇管培养方法对分离的132株细菌进行产酸能力初筛，表1结果表明，用对二甲胺基苯甲醛对摇管发酵液进行显色后，其中有6株菌株出现了蓝色变化（表1）。

表1主要初筛菌株的色氨酸产生结果序号菌种编号生物量(OD)色氨酸反应显色程度1B-021.012++2C-040.908++3D-021.025+++4H-011.015++5H-030.650++6S-050.804++注:“+++”、“++”和“+”分别表示反应显色的颜色深度:蓝色一级(深蓝色)、二级(藏蓝色)和三级(蓝色)。2.1.2色氨酸菌株的复筛将这6株菌株作为复筛试验进行复筛。其中，蓝色较深的菌株有1株，为D-02，表明可能产生较大量的色氨酸。通过对色氨酸标准溶液进行稀释侧OD，得出色氨酸标准曲线图如表2、图1。表2L-色氨酸标准曲线数据OD6000.0140.2040.370.3960.81.564色氨酸(g/L)0.040.050.080.10.20.4图1L-色氨酸标准曲线

由图1可知，L-色氨酸含量与OD值之间形成一条密切的直线关系。经线性回归，得到回归方程:Y=0.253X，测得复筛菌株D-02OD为1.025，计算得色氨酸含量为0.26g/L。再经摇瓶发酵72小时后色氨酸产量达到0.76g/L。2.2色氨酸产生菌的诱变选育通过紫外线的诱变，测定了紫外线的不同照射时间对出发菌株的致死率的影响，结果如图2所示。根据图所示结果，紫外线诱变处理的最佳时间为60秒。图2不同照射时间下的致死率通过对菌株D-02诱变，再进行摇管初筛和摇瓶复筛最后得到的产色氨酸菌株，在经摇瓶发酵72小时后，其色氨酸产量为6.70g/L，其产酸能力明显提高，并有望达到工业生产水平。2.3色氨酸产生菌的鉴定对产色氨酸菌株D-02进行革兰氏染色，显阳性。（图3）并参照根据《伯杰氏细菌分类手册》(第八版)，采用鉴定培养基对菌株D-02进行了多项有关分类鉴定方面的性能分析试验，结果如表3。图3菌株D-02的革兰氏染色图表3复筛分离菌株的生理生化性质注:b:生物素;“+”:阳性，“-”:阴性。

表3结果显示D-02与谷氨酸棒杆菌所显示的特征几乎完全相同，因此，初步确定它是谷氨酸棒状杆(Corynebacterium

glutanicum)，与目前谷氨酸钠(味精)工业化生产所使用的菌种一样，是安全性高的微生物菌株。2.4发酵条件对色氨酸的影响2.4.1pH的影响初始pH值不同对发酵的影响如图4所示。由图4得知，谷氨酸棒状杆菌的发酵培养基的最适初始pH值在7.0，在此条件下摇瓶发酵L-色氨酸产量为7.5g/L。pH在6～7时，色氨酸产量随pH升高而增加；在7～8时，色氨酸产量随pH升高而降低。图4初始pH值对菌体生长和发酵的影响

2.4.2温度的影响温度对L-色氨酸发酵的影响见图5。由图5可知，L-色氨酸发酵的最适温度为32℃。在32℃温度下，菌体生长好，菌体量大，L-色氨酸产量高。温度在28℃～32℃时，L-色氨酸产量随温度上升而增加；在32℃～36℃时，L-色氨酸产量随温度上升而降低。图5温度对L-色氨酸发酵的影响2.4.3装液量的影响 装液量对L-色氨酸的产量的影响如图6所示，由图可知，当装液量为25mL时，色氨酸产量最高，为7.4g/L。15mL～25mL时色氨酸产量逐渐升高，25mL～40mL时，色氨酸产量逐渐降低。图6装液量对L-色氨酸发酵的影响2.5菌株的保藏经过试验筛选出合适的菌株后，需要对菌株进行保藏。在无菌条件下，从相应斜面上挑取一大环菌株D-02接入盛有

1mL冻存液的1.5mL离心管中，标记为“L-tryptophan高产菌株D-02”，放入冰箱中冻存。2.6结论

A.根据微生物菌株色氨酸的代谢途径设计的细菌选择性培养基，大大增加了菌种筛选的定向性，直接、高效、迅速地筛选L-色氨酸生产菌株。

B.从土壤分离的细菌经过初筛和复筛试验，得到了1株L-色氨酸生产菌株。经过菌落形态观察和分类鉴定试验，初步确定为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium

glutanicum)。

C.菌株D-02，在经过紫外线照射的诱变育种后，色氨酸产量由

0.76g/L增加到6.70g/L，增加了近9倍。在最适pH为7.0，最适温度为32℃，最佳装液量为25mL下，其产酸量由6.70g/L变为7.60g/L，而且遗传形状稳定，具有较高的实际工业化开发应用潜力。讨论3.1菌株的选育此试验直接在土样中筛选出了L-色氨酸生成菌，如果在培养时加入色氨酸结构类似物5-氟-DL-色氨酸(5FT)、6-氟-DL-色氨酸(6FT)和5-甲基-DL-色氨酸(5MT),则有利于直接分离筛选出具备了在细菌生物合成L-色氨酸代谢途径中部分或者完全性地解除了特异性限制、反馈抑制或者阻遏作用