姜酚对大鼠血小板聚集的影响及其药效动力学研究

姜酚对大鼠血小板聚集的影响及其药效动力学研究

姜酚是姜科植物姜的主要成分之一。它也是姜科重要的活性成分。姜酚由系列结构类似的化合物组成,这些化合物分子结构中均含有3-甲氧基-4-羟基苯基官能团及烃链,根据烃链的长短可分为-、-、-、-、-姜酚(图1),其中-姜酚含量最高,为姜标志性化学成分。姜酚对二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、肾上腺素、胶原引起的血小板聚集有良好的抑制作用,明显抑制血小板环氧合酶活性和血栓素合成。体外研究显示,姜酚是一类新型、有潜力、可望替代阿司匹林的血小板活性抑制剂。本研究在姜酚药物动力学研究基础上,以-姜酚为血浆药物浓度指标、对ADP、AA诱导的大鼠血小板聚集的抑制率为药效指标,研究大鼠单剂量灌服姜酚后,不同时间点血浆-姜酚浓度与其对ADP、AA诱导的血小板聚集功能的影响,探讨药物效应、血药浓度、时间三者之间的关系,并求出相应的动力学参数,为姜的进一步开发利用提供依据。1各组大鼠血小板聚集检测姜酚,自制,HPLC法测定含-姜酚53%(w/w);-姜酚对照品,含量>98%,日本和光纯药工业株式会社;阿司匹林片,桂林南药股份有限公司。二磷酸腺苷(ADP)二钠盐、花生四烯酸(AA,美国Alexis公司);乙腈和甲醇(色谱纯,美国迪马公司);其他试剂均为市售分析纯;实验用水为超纯水。雄性SD大鼠(SPF级),体重(270±20)g,由广东省医学实验动物中心提供。实验前禁食不禁水12h。LBY-NJ2自动平衡血小板聚集仪(北京普利生公司);高效液相色谱仪(510泵、486紫外检测器、Millennium32色谱工作站,美国Waters公司)。大鼠随机分组,分为空白对照组、姜酚组、阿司匹林组、溶媒组,即:空白对照组(不给药)1组,8只;姜酚组7组,分别为灌服姜酚(240mg/kg)后5min、10min、15min、30min、60min、120min、240min,每个时间点1组,每组8只;阿司匹林组2组,分别为灌服阿司匹林(300mg/kg)后30min、60min,每个时间点1组,每组8只;溶媒组2组,分别为灌服0.5%吐温-80蒸馏水后10min、30min,每个时间点1组,每组8只。给药体积均为10ml/kg。各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350mg/kg体重)麻醉后,腹主动脉穿刺采血7ml,其中5.4ml注入含109mM枸橼酸钠抗凝剂0.6ml的硅化离心管中。另1.6ml全血置肝素管中,3000rpm离心10分钟,分离血浆,-80℃保存至测定。将枸橼酸钠抗凝血液于800rpm离心10min,小心吸取上层富血小板血浆(PRP)于带盖硅化试管中;余血3000rpm离心15min,吸取上层贫血小板血浆(PPP)。计PRP中的血小板数,用PPP稀释血小板计数在6～7×1011/L。按照Born氏比浊法,将加有300μlPRP和一个小磁棒的比浊管置于自动平衡血小板聚集仪恒温孔中,37℃预热5分钟,PPP调零后,在搅拌情况下加入诱导剂ADP(终浓度5μM)、AA(终浓度0.33mM)诱导聚集。记录300s内最大聚集率,计算血小板聚集的抑制率。血小板聚集抑制率计算公式:抑制率(%)=对照管血小板聚集%−给药管聚集%对照管血小板聚集%(%)=对照管血小板聚集%-给药管聚集%对照管血小板聚集%采用已建立的HPLC-UV法测定大鼠血浆中-姜酚的浓度。将姜酚药后各时间点采集的血浆从低温冰箱中取出,室温自然解冻,精密吸取0.2ml,置10ml具塞试管中,加乙醚1.5ml,旋涡混合30s,振荡5min,2400rpm离心10min,定量吸取乙醚层1.2ml移入尖底试管内,剩余血浆层再加乙醚1.5ml,同法萃取并离心,合并2次乙醚液,于水浴中(37℃),温和N2吹干,残余物用100μl流动相溶解,取20μl进样测定。实验数据以x¯±sx¯±s表示,采用SPSS12.0统计软件,应用两样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。绘制血浆-姜酚浓度-对AA诱导的大鼠血小板聚集抑制率-时间、血浆-姜酚浓度-对ADP诱导的大鼠血小板聚集抑制率-时间曲线图,分析三者之间的关系。2结果2.1adp、aa诱导的大鼠血小板聚集抑制率空白对照组大鼠血小板在AA、ADP诱导下的聚集率(%)分别为62.55±7.16,54.22±2.82。以空白对照组为对照,计算溶媒组(Dissolvant)、姜酚组(Gingerols)、阿司匹林组(ASA)灌服给药后各时间点对AA、ADP诱导的大鼠血小板聚集的抑制率,结果见表1。大鼠灌服姜酚后5min即对ADP、AA诱导的大鼠血小板聚集有极显著的抑制作用,作用持续30min。姜酚抑制AA诱导大鼠血小板聚集的最大效应(Emax)在82.26%～93.12%之间,抑制ADP诱导大鼠血小板聚集的Emax在75.33%～82.87%之间。2.2平均抑制率与时间将各时间点平均血浆-姜酚浓度、姜酚对AA、ADP诱导的大鼠血小板聚集的平均抑制率与时间作图(图2、3),可见-姜酚吸收迅速,10min血药浓度达峰值;血浆-姜酚浓度与对ADP、AA诱导的血小板聚集的抑制作用具有良好相关性,两者的经时过程是顺时针发生,在时间上无滞后现象。2.3x模型的线性化将各时间点平均血浆-姜酚浓度与姜酚对AA、ADP诱导的大鼠血小板聚集的平均抑制率作图(图4),可见姜酚对ADP、AA诱导的大鼠血小板聚集抑制的效应与血浆-姜酚浓度直接相关,可采用sigmoid-Emax模型来分析血浆-姜酚浓度与血小板聚集抑制率之间的量效关系。sigmoid-Emax模型(又称为Hill经验公式)表达形式:E=EmaxCsEC50s+Cs(1)E=EmaxCsEC50s+Cs(1)式中E为药物效应,C为药物浓度,Emax为对药物最大效应,EC50为引起最大效应一半时的药物浓度,s为陡度系数,又称Hill系数,其大小与效应-浓度曲线的陡度有关。将方程(1)重排,可得:lg(EEmax−E)=slglg(EEmax-E)=slgC-slgEC50(2)可实现线性化,求得EC50和s值。即:假设Y=lgEEmax−E‚X=lgC‚A=−slgY=lgEEmax-E‚X=lgC‚A=-slgEC50及B=s,则方程(2)可转化成线性方程式:Y=A+BX以实验中大鼠灌服姜酚后观察到的对AA,ADP诱导的血小板聚集最大抑制率为Emax,将各时间点的-姜酚血浆浓度(C)及对AA,ADP诱导的血小板聚集抑制率(E)代入公式中,计算出Y值及X值,用最小二乘法计算Y与X的线性回归方程,求得IC50和s值,结果见表2。3姜酚的药动学研究近年来,国外研究表明姜的主要活性成分姜酚及合成所得姜酚类似物具有良好抗血小板作用。在同样实验条件下,姜酚及其类似物较阿司匹林更具抗血小板聚集的能力。但这些研究主要集中于体外研究,关于姜酚对在体血小板功能的影响研究较少。而姜对血小板功能的影响临床研究结果不一。有研究提示姜临床用量对健康人的血小板功能、出凝血时间无影响;也有研究提示姜能抑制血栓素合成,有出血倾向的病人不适合服用姜,长期服用苯丙香豆素的病人加服姜后引起过度抗凝,出现鼻出血。分析其结果不一致的原因可能与姜使用的剂量有关。有报道,冠状动脉病患者每天口服4g姜粉,连用3个月,不影响ADP和肾上腺素诱导的血小板聚集,对纤溶活性和纤维蛋白原水平也无影响;但单剂量10g姜粉口服能明显抑制ADP和肾上腺素诱导的血小板聚集。本研究采用姜二氧化碳超临界提取物为原料制备姜酚,其中-姜酚的含量高(53%,w/w),以此为供试药。前期药动学研究结果显示,大鼠单剂量口服后,-姜酚吸收迅速,达峰时间为0.17h,半衰期为1.77h。故选择药后5min、10min、15min、30min、60min、120min、240min为观察时间点,考察姜酚大剂量(大鼠LD50的1/10)单次给药后抗血小板作用及其经时过程,考察姜酚抗血小板作用与血药浓度的关系。结果表明姜酚对AA、ADP诱导的大鼠血小板聚集有良好抑制作用,其作用效应随血药浓度升高而增强,抑制AA、ADP诱导血小板聚集的平均-姜酚IC50分别为1.36μg/ml、1.34μg/ml,量效曲线斜率大,血药浓度稍有增减,效应即明显变化;其经时过程显示,药效作用与血药浓度在时间变化上无滞后现象。提示姜酚口服给药后,吸收迅速,药物原形可能直接作用于血浆中的血小板,抑制诱聚剂激活血