egcg及其氧化产物的抑菌活性研究

egcg及其氧化产物的抑菌活性研究

儿茶素是茶多酚中的一种活性物质。它具有抗高血压、氧化、无菌、抗癌、抗癌等多种生理效果。过去人们常常认为其酚羟基氧化后会导致其活性降低或丧失。但人们逐渐发现儿茶素类氧化产物也具有很高活性,甚至在某些方面超过了未氧化的儿茶素。目前,国内外对儿茶素氧化产物的活性研究主要集中在抗氧化方面,而对其抑菌作用的报道尚不多见。且以往研究主要以红茶提取物和茶色素为研究对象,而红茶提取物和茶色素除含有多酚氧化产物外还含有黄酮醇类,咖啡碱及其它成分,并不能完全代表儿茶素类氧化产物的生物活性。因此本文以儿茶素中含量最高,活性最强的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)为前体物质进行体外氧化,比较EGCG及其不同氧化级分的抑菌作用,为深入认识酚类氧化产物提供参考。1材料和方法1.1微生物成果质量指标表没食子儿茶素没食子酸酯,纯度大于99%,购自美国Sigma公司。供试大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)、微小毛霉(Mucorpusillus)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)均由华中农业大学食品科技学院微生物教研室提供。营养琼脂培养基、马铃薯(PDA)培养基。1.2实验方法1.2.1中性氧化反应参照WanXC的方法,将K3Fe(CN)6与NaHCO3按一定比例配制成化学氧化剂,滴加到EGCG溶液中,启动氧化反应。水浴25℃,反应15min后,立即在pH7.0条件下,用乙酸乙酯萃取,得到中性氧化级分EOFA(EGCGoxidationfractionA);再立即调节反应液pH至2.0,用乙酸乙酯萃取,得到酸性氧化级分EOFB(EGCGoxidationfractionB)。将两级分进行旋转蒸发,冷冻干燥备用。1.2.2hplc分析条件1.2.2.流动相aa色谱柱PhenomenexC18(4.6mm×250mm,5μm),流动相A为乙酸(2%);流动相B为乙腈;流速0.8mL/min,柱温40℃,检测波长280nm,进样量10μL;0～50min流动相B线性梯度变化8%～31%,53min时回到8%。1.2.2.干燥温度cs电喷雾电离(ESI),扫描方式:负离子扫描(ESIm/z100～2000),喷雾气压力30.0psi,干燥温度300℃,干燥气体的流速8.0L/min,毛细管电压为4.0kV。1.2.3用于培训的平板制造商配制好的各种菌株的培养基,经高压蒸汽消毒灭菌后,冷却至50～60℃,无菌操作倾入干热灭菌的培养皿内,迅速摇匀,冷却凝固后备用。1.2.4悬浮液的制备把各种供试菌菌种用其适宜的斜面培养基进行活化后,用无菌生理盐水制成含菌量约为106～107CFU/mL的菌悬液。1.2.5抗菌试验抑菌实验采用滤纸片法。用打孔器将滤纸制成直径为6mm的圆片,高温蒸汽杀菌后烘干备用。1.2.5.抑菌圈测定将EGCG、EOFA、EOFB配置成2mg/mL溶液,以无菌操作将滤纸片浸泡于其中12h。菌悬液注100μL到平板上,用涂布棒涂抹均匀后放置约20min。用无菌镊子取浸泡滤纸片,沥干后贴到培养基上,于37℃恒温培养细菌24h,28℃恒温培养真菌48h,测量抑菌圈大小,以无菌水作对照,两者直径作比值。重复两次取平均值。1.2.5.最低抑制浓度测定将EGCG、EOFA、EOFB溶液用无菌水进行稀释,制备系列浓度稀释液,测定样品对所选菌株的最低抑制浓度(MIC),实验过程同1.2.5.1。重复两次取平均值。1.2.6温度对抑菌圈的影响将EGCG、EOFA、EOFB溶液置不同温度下处理30min,用滤纸片法测定不同温度处理下样品的抑菌圈直径,并以无菌水作对照,两者直径作比值。重复两次取平均值。1.2.7不同ph值的柠檬酸缓冲液抑菌圈的测定EGCG、EOFA、EOFB溶液用碳酸氢钠和柠檬酸缓冲液调配成不同pH,用滤纸片法测定不同pH下样品的抑菌圈直径,并以不同pH值的缓冲液作对照,两者直径作比值。重复两次取平均值。1.2.8盐浓度对抑菌圈的影响EGCG、EOFA、EOFB用不同浓度的氯化钠溶液溶解,测定不同盐浓度下样品的抑菌圈直径,并以不同浓度氯化钠溶液作对照,两者直径作比值。重复两次取平均值。2结果与讨论2.1儿茶素氧合合成高效聚氧合物的制备方法由图1可知,级分EOFA主要含有EGCG及氧化产物1、2;级分EOFB主要含有氧化产物1、3。HPLC/MS分析表明,产物1m/z911,产物2m/z929,产物3m/z911,EGCGm/z457。Lewis和Sang等人曾报道,儿茶素氧化聚合物可通过儿茶素B环或D环上的-OH氧化成邻醌,再由邻醌配对发生氧化偶合或是两单体间通过C-C单键相连聚合而成。根据分子量推测产物1、产物3为EGCG脱氢二聚体([2M-4H],MEGCG=458Da),二者虽然分子量相同,但结合方式不相同,从而导致极性上的差异;产物2为EGCG通过B环偶合而得的邻醌二聚体。因此,EGCG氧化聚合的主要产物为EGCG二聚体。2.2其他菌株的抑菌活性表1为EGCG、EOFA、EOFB对不同菌株的抑制效果。结果表明,EGCG及其氧化级分对霉菌、酵母无明显的抑制作用,而对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较为明显的抑制作用。被抑制的细菌中既有革兰氏阳性菌又有革兰氏阴性菌,既有球菌,又有杆菌,可见EGCG及其氧化级分有着广谱的抑菌作用。抑菌效果为:EGCG>EOFA>EOFB,氧化级分的抑菌活性略低于EGCG。分析其原因为:随聚合度的增加,儿茶素氧化产物的分子量增大,难以透过细菌的细胞膜;加之,受大分子的空间位阻效应影响,酚羟基的活性被削弱,从而导致了抑菌能力的下降。2.3ecgg、eofa、eofb的浓度对抑菌活性的影响EGCG、EOFA、EOFB对三种细菌最低抑菌浓度结果见表2,可看出随着EGCG、EOFA、EOFB浓度的降低,它们的抑菌活性也随之降低。EGCG、EOFA及EOFB对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为0.2mg/mL,对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为0.01mg/mL。2.4抑菌活性的影响以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为供试菌,不同温度处理下样品的抑菌效果见表3。由表可知,温度对样品的抑菌活性有一定影响,特别是在40℃下加热30min,EGCG、EOFA抑菌活性大幅下降,但随温度进一步升高,抑菌活性保持稳定;级分EOFB在80℃处理30min后无抑菌活性,这可能是因为EOFB中,氧化产物1和3的EGCG脱氢二聚体结构对热不稳定,在高温下易降解所致。2.5ph值对ecgg及氧化级分抑菌效果的影响以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为供试菌,不同pH值下样品的抑菌效果见表4。由表可知,pH值对样品抑菌有较明显的影响,在pH为4～6的弱酸性范围,EGCG及氧化级分抑菌效果好。在强酸及碱性范围内,抑菌效果明显下降。这是因为EGCG及其氧化产物在结构上具有较多酚羟基,为弱酸性物质,经强酸或强碱处理后会发生不同程度的转化,从而导致抑菌活性降低。2.6抑菌效果分析以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为供试菌,不同氯化钠浓度下样品的抑菌效果见表5。由表可知,样品中加一定量的氯化钠可增强它们的抑菌活性,当氯化钠浓度为0.8mol/L时,样品的抑菌效果最为明显,可能为氯化钠与样品的协同增效作用。3ecgg及其氧化级分的抑菌活性本研究结果表明,EGCG及其氧化级分对细菌有较强的抑制作用,对真菌、酵母菌无明显的抑制作用。其中EGCG、EOFA及EOFB对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度均为0.2mg/